徐秋穎， 劉偉偉， 王寶家， 馬秀英， 高永翔

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是許多病因各異的肺間質(zhì)疾病的共同結(jié)局，是以肺泡持續(xù)性損傷、成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積而導(dǎo)致肺組織反復(fù)破壞、修復(fù)，最終造成肺組織中的大量膠原沉積為病理特點(diǎn)的一類(lèi)疾病[1]。組織器官纖維化是許多疾病致殘、致死的主要原因，統(tǒng)計(jì)表明，特發(fā)性PF患者從疾病診斷到死亡的時(shí)間2～5年，5年生存率僅20%[2]。臨床上，這類(lèi)患者多使用糖皮質(zhì)激素治療，但是只有1/3的患者對(duì)糖皮質(zhì)激素有一定的療效，并且長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素會(huì)出現(xiàn)很多不良反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，傷口難愈合等[3]。目前國(guó)際公認(rèn)的最有效的治療方式是肺移植。但是肺移植存在肺供體少、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大、技術(shù)要求高、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn),很難在PF的治療中廣泛應(yīng)用。因此, 拓展新的治療措施具有重要的意義。

康復(fù)新液是由美洲大蠊[拉丁學(xué)名：Periplanetaamericana(L.)]干燥蟲(chóng)體的乙醇提取物制成的溶液，其主要成分包括氨基酸(17 種以上，包含人體必須氨基酸)、肽類(lèi)(抗菌肽、咽側(cè)體抑制神經(jīng)肽、焦激肽等)、多糖類(lèi)(硫酸粘多糖等)、核苷類(lèi)(肌酐、次黃嘌呤、尿嘧啶等)及油脂類(lèi)等[4]?？祻?fù)新液可“通利血脈，養(yǎng)陰生肌”，內(nèi)服可治消化道出血與潰瘍等，外用可療金瘡、外傷等，具有改善黏膜創(chuàng)面微循環(huán)、加速機(jī)體病損組織修復(fù)再生、增強(qiáng)免疫等功能[5]。研究顯示，康復(fù)新液可改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，治療小兒手足口病、帶狀皰疹、干癥、頭頸部惡性腫瘤等[6]。本研究旨在從干預(yù)PF的角度，對(duì)中成藥康復(fù)新液進(jìn)行二次開(kāi)發(fā)再評(píng)價(jià)，從而給康復(fù)新液對(duì)PF疾病的治療提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 Wistar大鼠[成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司許可證號(hào)：SCXK(川)：2013-24]，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)溫江實(shí)驗(yàn)樓。

1.1.2主要藥物及儀器 康復(fù)新液(批號(hào)：B170314，四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司)；地塞米松(批號(hào)：161236，浙江仙琚制藥股份有限公司)；博來(lái)霉素(blcomycin,BLM，批號(hào)：A0405A，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡(NIKON-E200，日本尼康公司)；電腦自動(dòng)脫水機(jī)(TSJ-SD，常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ型包埋機(jī)(JB-P5，常州市中威電子儀器有限公司);病理切片機(jī)(HM325，賽默飛世爾中國(guó)科技公司)。DAB顯色劑(批號(hào)：K5007， 丹麥DAKO公司)；TRIzolTMLS Reagent(批號(hào)：A33252，美國(guó)ThermoFisher公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit(批號(hào)：FSQ-201，日本 Toyobo公司);SYBRTMGreen Realtime PCR Master Mix(批號(hào)：QPK-201， 日本Toyobo公司);Fibronectin抗體(批號(hào)：ab2413 ，英國(guó)Abcam公司);α-SMA抗體(批號(hào)：ab124964，英國(guó) Abcam公司);HRP標(biāo)記羊抗鼠與羊抗兔(批號(hào)：511103與511203，成都zenbiosciene公司);RIPA裂解液(批號(hào)：P0013B，南京byeotime生物技術(shù)有限公司);PVDF(批號(hào)：IPVH00010，美國(guó) Millipore公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 Wistar大鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組以及模型鼠康復(fù)新液治療組(康復(fù)新液組)、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組(DXM組)。

1.2.2造模 大鼠腹腔注射麻醉，除對(duì)照組外,其他各組參照文獻(xiàn)[7-8]方法氣管內(nèi)一次性注射BLM 5 mg/kg建立PF大鼠模型；對(duì)照組則注射等體積的生理鹽水。

1.2.3給藥 康復(fù)新液組采用康復(fù)新液治療，劑量為5 mL·kg-1·d-1 [9-10]；DXM組采用DXM治療，劑量為0.25 mg·kg-1·d-1。灌胃周期均為21 d。

1.2.4標(biāo)本處理 用股動(dòng)脈放血的方式處死大鼠。打開(kāi)大鼠胸腔，取出全肺組織，使用生理鹽水沖洗，沖洗后取左肺組織，固定于10%甲醛中24 h，石蠟包埋,切片,進(jìn)行H-E、馬松(Masson)染色。取右肺組織保存于DEPC水處理過(guò)的EP管中,分組標(biāo)記后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱凍存,用于后續(xù)實(shí)時(shí)定量PCR及WB檢測(cè)，方法參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.5實(shí)時(shí)定量PCR方法 使用TRIzolTMLS Reagent進(jìn)行RNA抽提，NanoDrop2000測(cè)定RNA濃度，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit按照1 μg/10 μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，之后以GAPDH為內(nèi)參，于qRT-PCR儀檢測(cè)α-SMA，LN，F(xiàn)N，CTGF，Collagen I及Collagen Ⅲ的mRNA表達(dá)。20 μL反應(yīng)體系：Mix(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L濃度)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，無(wú)核酸酶水6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s→95 ℃變性 5 s→60 ℃退火延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平的分析。檢測(cè)引物(由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成)名稱及序列：

GAPDH-s：GGCAAGTTCAACGGCACA

GAPDH-a：TCTCGCTCCTGGAAGATGG

LN-s：AGCAACTCAGCAGATACCCG

LN-a：CCAGCTCATTTACTCCCGTCA

FN-s：GCACATCCCACCAACAACCC

FN-a：GGACCTCCTCATCTACATTCGGC

α-SMA-s:AATGACCCAGATTATGTTTGAGACCT

α-SMA-a：TCCAGAGTCCAGCACAATACCAG

1.2.6Western-blot方法 稱取適量組織樣品，按照0.1 g/mL的比例加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，進(jìn)行組織勻漿，徹底裂解組織，之后在4 ℃下裂解20 min，12 000 r/min離心5 min后收取上清；BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整濃度至4 mg/mL，加入2×蛋白上樣緩沖液，SDS-PAGE分離條帶，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA封閉1 h后加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3 次后加入對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h后用TBST洗滌3 次，加入ECL底物發(fā)光液與化學(xué)發(fā)光成像儀下拍照。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學(xué)觀察 H-E染色可見(jiàn)：對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡大小相對(duì)一致，肺泡間隔無(wú)增寬；模型組肺泡大小不一，有的肺泡明顯縮小，肺泡間隔不同程度增寬，可見(jiàn)纖維組織增生伴少許炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，DXM組肺泡間隔明顯變窄，炎細(xì)胞數(shù)量也明顯減少；康復(fù)新液組的肺泡間隔也有所變窄，但不如DXM組明顯(圖1A)。Masson染色可見(jiàn)：膠原被Masson染液染成藍(lán)色，對(duì)照組大鼠肺組織中膠原染色主要位于小管基底膜及其周?chē)?；模型組大鼠肺組織中可見(jiàn)肺泡間隔厚薄不一，并不同程度地被染成藍(lán)色。與模型組比較，DXM組和康復(fù)新液組肺組織藍(lán)色區(qū)域均明顯減少，但DXM組更明顯(圖1B)。

2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組的LN，F(xiàn)N及α-SMA mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，表明造模后模型組中的LN，F(xiàn)N及α-SMA這3種PF因子表達(dá)明顯上調(diào)，證明造模成功(P<0.001)。與模型組比較，康復(fù)新液組的LN，F(xiàn)N及α-SMA mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.001)；與模型組比較，DXM組的LN，F(xiàn)N及α-SMA mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，表明康復(fù)新液與DXM對(duì)PF大鼠的PF有改變作用(P<0.001)；與DXM組比較，康復(fù)新液組LN，F(xiàn)N及α-SMA的mRNA表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.3Western-blot檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組的LN,FN及α-SMA 蛋白水平上升明顯，說(shuō)明造模后模型組中的LN，F(xiàn)N及α-SMA這3種PF因子表達(dá)上調(diào)，證明造模成功。與模型組比較，康復(fù)新液組的LN，F(xiàn)N及α-SMA蛋白表達(dá)明顯下調(diào)；與模型組比較，DXM組的LN，F(xiàn)N及α-SMA蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，表明康復(fù)新液與DXM對(duì)PF大鼠的PF有改變作用；與DXM組比較，康復(fù)新液組的LN，F(xiàn)N及α-SMA蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

LN: 層連結(jié)蛋白; FN:纖維連結(jié)蛋白; α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白. 組間比較，△:P<0.01.圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組LN,FN及α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)情況Fig 2 Relative mRNA expression levels of LN，F(xiàn)N and α-SMA in different groups

3 討 論

PF是一種進(jìn)行性不可逆的肺部疾病，目前使用的PF動(dòng)物模型普遍選用經(jīng)典的BLM誘導(dǎo)的大鼠或者小鼠模型。BLM是臨床上常用的抗腫瘤藥物，給藥后全身各組織均有分布，主要的副作用是肺毒性，可以引起肺泡炎并很快進(jìn)展為肺間質(zhì)的纖維化。先前的研究已證實(shí)，大鼠氣管內(nèi)一次性灌注BLM可以形成類(lèi)似人類(lèi)彌漫性肺間質(zhì)纖維化的病變[12]。因此，本研究采用BLM復(fù)制PF大鼠模型。

肺纖維化的形成過(guò)程中，在最重要細(xì)胞因子TGF-β1的刺激作用下，成纖維細(xì)胞激活并轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞[13]，肌成纖維細(xì)胞的胞漿豐富，分泌膠原同時(shí)還具有收縮功能，它具備成纖維細(xì)胞和平滑肌的雙重特性，肌成纖維細(xì)胞的形成是造成ECM異常沉積的主要細(xì)胞。所以，肺成纖維細(xì)胞不斷增殖并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是PF發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵所在。這個(gè)過(guò)程中，肌成纖維細(xì)胞會(huì)表達(dá)α-SMA這種獨(dú)特的分子，同時(shí)大量合成和分泌ECM[14]，從而形成了纖維灶。這期間，α-SMA的增多可顯著增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞的遷移及收縮能力[15]，進(jìn)而ECM的合成和分泌功能增強(qiáng)，因此本研究選取了α-SMA作為反應(yīng)肺纖維化的程度指標(biāo)。α-SMA表達(dá)水平的上調(diào)說(shuō)明成纖維細(xì)胞發(fā)生了向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，相反α-SMA表達(dá)的下調(diào)也反映了抗纖維化的有效。另一方面，PF形成過(guò)程中ECM的作用不容忽視。ECM成分在肺泡和間質(zhì)內(nèi)沉積，使纖維組織過(guò)度修復(fù)不斷取代正常的肺組織，進(jìn)而造成正常肺組織的破壞。ECM的主要成分是FN和LN，F(xiàn)N可以誘導(dǎo)膠原的形成，從而導(dǎo)致臟器的纖維化[16]。生理情況下ECM處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，使FN，LN及膠原的合成與降解基本一致，不會(huì)出現(xiàn)ECM的過(guò)度積聚而形成纖維化，反之這個(gè)動(dòng)態(tài)平衡如果被打破，ECM的降解減少，臟器則可能會(huì)出現(xiàn)纖維化病變[17]。所以本研究還選取了LN和FN作為反應(yīng)肺纖維化的程度指標(biāo)。LN和FN表達(dá)水平的上調(diào)說(shuō)明出現(xiàn)ECM沉積，出現(xiàn)組織的纖維化，相反則說(shuō)明抗纖維化有效。因此，本研究選取LN，F(xiàn)N及α-SMA這3種反映肺部纖維化程度的因子作為治療藥物康復(fù)新液及DXM對(duì)PF是否有效的客觀指標(biāo)。

LN:層連結(jié)蛋白; FN:纖維連結(jié)蛋白; α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白； 1:對(duì)照組； 2：模型組； 3:康復(fù)新液組； 4:地塞米松組.圖3 WB檢測(cè)各組LN，F(xiàn)N及α-SMA 3種蛋白表達(dá)情況Fig 3 Protein expression levels of LN, FN and α-SMA in different groups

本研究結(jié)果顯示，在給予康復(fù)新液進(jìn)行藥物干預(yù)后，顯微鏡下觀察顯示，康復(fù)新液組與模型組肺組織比較纖維化有明顯改善，表明康復(fù)新液可以改善PF大鼠模型的肺纖維化程度；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，模型組肺組織中LN，F(xiàn)N及α-SMA這3種PF因子在mRNA水平表達(dá)明顯上調(diào)，經(jīng)康復(fù)新液治療后上述指標(biāo)表達(dá)均有所下調(diào)，而WB結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果基本一致，表明康復(fù)新液可減輕BLM誘導(dǎo)的大鼠PF程度，其作用可能與其下調(diào)肺組織中LN，F(xiàn)N及α-SMA蛋白表達(dá)有關(guān)?？祻?fù)新液的抗纖維化作用是否還通過(guò)TGF-β/Smad或是其他信號(hào)通路起作用？由于本實(shí)驗(yàn)中康復(fù)新液和DXM都可減少PF大鼠的纖維化程度，而與DXM比較，康復(fù)新液毒副作用小，作用緩慢且持久。因此，筆者將繼續(xù)研究康復(fù)新液對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞模型的干預(yù)，以探究其分子機(jī)制。