李詠梅，任貽超,2，姜森灝，王金葉，王仁杰，李 超

( 1.青島農(nóng)業(yè)大學 海洋科學與工程學院，山東 青島 266109； 2.科拓恒通乳酸菌產(chǎn)業(yè)研究院,山東 青島 266108； 3.鹽城師范學院，江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點實驗室, 江蘇 鹽城 224051 )

近年來，高密度、集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)快速發(fā)展，水體自身污染問題也極為突出[1]，養(yǎng)殖系統(tǒng)含氮營養(yǎng)鹽過剩累積，水質(zhì)惡化極易引起水生動物病害[2]。水體中氨氮達到一定含量后，非離子氨易透過細胞膜進入體內(nèi)，使得水生動物自身的生理調(diào)節(jié)不能補償高鐵血紅蛋白升高而引發(fā)的體內(nèi)組織缺氧，即中毒癥狀[3]，水體氨氮含量過高威脅水生生物生長、誘發(fā)魚病[4]。近年來，利用有益微生物的代謝作用消除水體過量的氮取得了一定成效，如發(fā)現(xiàn)光合細菌(Rhodopseudomonassphaeroides)[5]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[6]、硝化細菌[7]、裂殖酵母菌(Schizosaccharomycessp.)[8]及短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)[9]等均具有凈化水質(zhì)的作用。

乳酸菌是一類可代謝碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細菌，能夠在養(yǎng)殖動物腸道定殖，具有抑菌、提高免疫和促進生長的作用[10-11]，常添加到飼料或潑灑到養(yǎng)殖水體中。針對魚病爆發(fā)問題，漁源乳酸菌資源的篩選和應用備受關(guān)注，但是，乳酸菌對水質(zhì)的作用效果還缺少足夠的量化研究，嚴重限制了乳酸菌資源的深度開發(fā)利用。筆者自野生漁獲物腸道中分離到抑菌型乳酸菌菌株，研究了不同漁源乳酸菌菌株去除養(yǎng)殖水體氨氮的效果，為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌菌株分離

利用平板劃線法，從野生和養(yǎng)殖的鰣魚(Hilsareevesi)、沙丁魚(Sardinopsmelanosticta)、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)等腸道內(nèi)分離出漁源乳酸菌。采用MRS固體培養(yǎng)基加入1%溴甲酚紫染液，混勻后經(jīng)120 ℃高壓滅菌備用。菌株經(jīng)溶鈣圈法初步培養(yǎng)后，在溴甲酚紫染液的培養(yǎng)基劃線，封口后置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，進一步篩選革蘭氏陽性、使溴甲酚紫由紫色變黃色的單菌落。利用牛津杯法檢驗菌株的抑菌效果，獲得對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鰻弧菌(V.anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)有明顯抑制效果的菌株。經(jīng)過生理生化特征分析后，分別對菌株編號后進行16S rDNA鑒定，并利用Mega 6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，用鄰接法基于核苷酸Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2 養(yǎng)殖海水制備及試驗設(shè)計

從實驗室養(yǎng)殖系統(tǒng)中獲取魚類養(yǎng)殖海水，水體中氨氮初始含量達0.28 mg/L。試驗水溫為25 ℃，鹽度為35，pH為8.3。取1000 mL的錐形瓶，加入800 mL上述養(yǎng)殖海水，分別用單一菌株及4株菌的等量混合液處理。同時，每個處理分成2組，分別為添加10 mL菌體培養(yǎng)液組(G1組)和添加10 mL菌體培養(yǎng)液的離心菌體組(G2組)，以不添加乳酸菌的處理為對照組(CG組)，每個處理組設(shè)3個重復。試驗初期在各處理組海水中乳酸菌菌體密度達107cfu/mL。分別于試驗開始后的1、2、3、4、5 d取樣，參照國家標準海洋監(jiān)測規(guī)范(GB 17378.4—2007)第4部分海水分析的方法測定水體中氨氮的含量。

1.3 數(shù)據(jù)計算與處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，不同處理組的氨氮水平比較分析采用單因子方差分析，采用Kolmogorov-Smirnov test進行正態(tài)分布檢驗，利用Levene′s test進行方差齊性檢驗，利用Duncan′s檢驗對數(shù)據(jù)進行比較分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

本研究得到對金黃色葡萄球菌、鰻弧菌、副溶血弧菌均具有明顯抑制作用的菌株4株(編號分別為L8，L10，L11，L14)。所得4株菌株均為革蘭氏陽性，能產(chǎn)生溶鈣圈，使溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色。經(jīng)生理生化特征及16S rDNA鑒定結(jié)果表明，菌株L8、L10、L11、L14分別為魏斯氏乳酸菌(Weissellaconfuse)、植物乳桿菌(L.plantarum)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。篩選菌株的生理生化特征見表1，進化關(guān)系聚類分析見圖1。

表1 分離菌株的生理生化特征

注：+表示陽性；-表示陰性.

圖1 基于16S rDNA的聚類分析圖

2.2 單一乳酸菌菌株降解養(yǎng)殖水體氨氮的作用

試驗期間，經(jīng)4株乳酸菌菌株處理后，養(yǎng)殖海水中氨氮的含量顯著低于空白對照組(P<0.05)。由圖2～圖5可知，不同乳酸菌的單菌株均能顯著降低水體的氨氮含量，但降解能力存在差異。每個單一菌株處理的水體氨氮含量均在第1 d最高，接下來變化趨勢相對穩(wěn)定。在各處理組中，菌體營養(yǎng)液組和離心菌體組對氨氮的利用效果無顯著性差異(P>0.05)，其中，魏斯氏乳酸菌處理的水體24 h氨氮質(zhì)量濃度降至0.15 mg/L和0.16 mg/L，降解率分別達41.48%和37.20%，至第5 d，養(yǎng)殖水體的氨氮質(zhì)量濃度分別降至0.10 mg/L和0.10 mg/L，比對照組分別下降了30.52%和31.90%(圖2)；植物乳桿菌處理養(yǎng)殖水體24 h氨氮質(zhì)量濃度分別降至0.15 mg/L和0.16 mg/L，降解率分別達35.10%和32.50%，截至第5 d，養(yǎng)殖水體氨氮水平分別降至0.08 mg/L和0.09 mg/L，比對照組分別下降44.50%和43.20%(圖3)；糞腸球菌處理的養(yǎng)殖海水氨氮質(zhì)量濃度分別降至0.14 mg/L和0.15 mg/L，降解率分別達44.00%和42.10%，截至第5 d，養(yǎng)殖水體的氨氮水平降至0.08 mg/L和0.07 mg/L，比對照組分別下降45.10%和50.05%(圖4)；乳酸乳球菌處理水體經(jīng)24 h后，水體氨氮質(zhì)量濃度降至0.15 mg/L和0.16 mg/L，降解率分別達41.20%和36.40%，截至第5 d，水體的氨氮水平分別降至0.08 mg/L和0.09 mg/L，降解率為47.50%和43.20%，比對照組分別下降44.50%和41.60%(圖5)。

圖2 魏斯氏乳酸菌對養(yǎng)殖水體氨氮的降解效果不同小寫字母表示相同處理組不同時間差異顯著；不同符號表示相同時間不同處理間差異顯著(P<0.05).圖3～圖6同.

圖3 植物乳桿菌對養(yǎng)殖水體氨氮的降解效果

圖4 糞腸球菌對養(yǎng)殖水體氨氮的降解效果

圖5 乳酸乳球菌對水體中氨氮的降解效果

2.3 混合乳酸菌菌株降解養(yǎng)殖水體氨氮的作用

4株乳酸菌菌株等量混合后處理水體第1 d，菌體培養(yǎng)液組水體中氨氮質(zhì)量濃度與對照組差異不顯著(P>0.05)，分別于第2 d和第4 d顯著下降(P<0.05)；而離心菌體組第1 d較空白對照組顯著下降(P<0.05)，之后維持穩(wěn)定，至第4～5 d，再次顯著下降(P<0.05)。截至第5 d菌體培養(yǎng)液組氨氮水平比空白組下降了37.70%，離心菌體組氨氮水平比空白組下降了40.20%，菌體培養(yǎng)液組和離心菌體組水體氨氮質(zhì)量濃度變化差異不顯著(P>0.05)(圖6)。第5 d對照組水體的氨氮水平較第1 d下降22.60%。與單一菌珠相比，在試驗的前2 d混合菌株處理組對氨氮的降解能力弱于單一乳酸菌。

3 討 論

3.1 乳酸菌單菌株對水體氨氮的降解作用

乳酸菌不僅表現(xiàn)在魚類腸道中維持有益菌群平衡，提高魚類免疫機能[11]，同時，在養(yǎng)殖水環(huán)境中維持足夠的密度也能起到有效的水質(zhì)凈化效果。水環(huán)境中的氨氮是無機氮的主要形態(tài)，是導致水體富營養(yǎng)化和水質(zhì)惡化的重要水質(zhì)指標之一。水體中氨氮含量過高，會導致水產(chǎn)品品質(zhì)下降甚至大量死亡。以往消除水產(chǎn)養(yǎng)殖水體過量氨氮的方法通常是利用沸石粉、硅膠、活性炭等吸附劑的吸附作用，利用微生物技術(shù)的生物脫氮是當前去除氨氮最經(jīng)濟有效的方法。相對于傳統(tǒng)的物理和化學方法，生物脫氮主要利用生物自身代謝活動，通過硝化和反硝化過程實現(xiàn)快速脫氮[12]?；谙趸毦南趸饔玫纳锩摰夹g(shù)是當前污水處理的主攻方向，但是，由于硝化細菌培養(yǎng)難度大，能源消耗和運行成本高，開發(fā)高效節(jié)能的氨氮降解方法勢在必行。當前，除了利用硝化細菌外，生產(chǎn)中還利用芽孢桿菌降解養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽含量，提高水體中殘餌分解效率[13-15]。

圖6 混合乳酸菌菌株對水體中氨氮的作用效果

本試驗中的魏斯氏乳酸菌、植物乳桿菌、糞腸球菌和乳酸乳球菌均屬乳酸菌，是定殖在胃腸道的優(yōu)勢菌群，能促進動物生長、抑制病原菌、提高免疫力和成活率等[16-19]。這些菌株的應用主要體現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)、腸道健康、拮抗病原菌和產(chǎn)生天然抗生素等方面，尤其關(guān)注通過飼料添加在腸道中發(fā)揮作用。水產(chǎn)養(yǎng)殖中的施用方式主要有飼料添加和水池潑灑，而對于乳酸菌在水環(huán)境中的作用機理研究還不足。研究發(fā)現(xiàn)，自水產(chǎn)環(huán)境中分離的植物乳桿菌對亞硝酸鹽具有凈化去除作用[20]；乳酸菌對亞硝酸鹽的去除作用機理包括直接化學反應作用和間接推動微生物的反硝化作用[21]。本研究中的4種乳酸菌在分別添加離心菌體和菌體營養(yǎng)液后均表現(xiàn)出顯著降解養(yǎng)殖廢水氨氮的作用， 1 d內(nèi)養(yǎng)殖水體氨氮降解率分別達41.48%和37.20%，35.10%和32.50%，23.90%和29.27%，29.70%和23.90%。本試驗中乳酸菌消除氨氮的作用可能體現(xiàn)在對亞硝酸鹽的利用間接推動了硝化作用，也可能由于菌株產(chǎn)生的酶系對氮源的利用。乳酸菌對水體氨氮去除作用的機理還有待深入研究，以便針對性開展菌株馴化與應用。張博[22]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)等在24 h之內(nèi)對氨氮的降解率高達75%。本研究中的4株漁源乳酸菌在24 h內(nèi)對養(yǎng)殖水中氨氮的降解率變化范圍為23.90%～41.50%，低于上述芽孢桿菌。這可能與不同細菌代謝活性、使用環(huán)境及使用量有關(guān)。芽孢桿菌在環(huán)境中的抗逆性強，而乳酸菌活菌數(shù)量易受環(huán)境變化的影響[23]。本試驗中的單株乳酸菌對氨氮的降解速率第1 d較高，在第2～5 d時降解速率較平緩。這可能是由于第1 d時菌量較多，活力較強，但乳酸菌的生命周期較短，加上對水中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，1 d后對水體中氨氮利用能力下降。在水質(zhì)調(diào)控應用中，需要根據(jù)水體中菌量及水體營養(yǎng)狀況控制益生菌的用量。本試驗對照組自身氨氮水平出現(xiàn)下降，屬于水系統(tǒng)在物理、化學和生物作用下的自我凈化[24]，但其自凈能力明顯低于微生物處理組。本研究中的乳酸菌能明顯而快速地降低養(yǎng)殖用水的氨氮，但不同水體環(huán)境下的具體施用量、施用方法、施用時間等還需根據(jù)水體及養(yǎng)殖生物的實際情況綜合考量。目前尚缺少對魏斯氏乳酸菌的系統(tǒng)性研究，有研究發(fā)現(xiàn)，魏斯氏乳酸菌可能參與了宿主體內(nèi)纖維素的降解過程，并且其對蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等的抑制特性，使得其在食品加工保存領(lǐng)域有潛在的應用價值[25]。有研究表明，糞腸球菌屬于條件致病菌，但其致病性是多功能多因子協(xié)同作用的結(jié)果，不同來源菌株攜帶的毒力因子不盡相同。另外，糞腸球菌也是經(jīng)國家農(nóng)業(yè)部許可的飼用微生物添加劑之一，可作為一種益生菌在食品工程和畜禽養(yǎng)殖等領(lǐng)域得到應用[26]，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用報道極少。本試驗關(guān)于魏斯氏乳酸菌和糞腸球菌在水體中的作用效果研究尚屬首次報道，有必要深入開展以上菌株針對不同宿主動物的益生作用研究與論證，明確體外環(huán)境和體內(nèi)免疫的協(xié)同調(diào)節(jié)機制，實現(xiàn)在水產(chǎn)環(huán)境中的應用。

3.2 乳酸菌復配菌株對水體氨氮的降解作用

傳統(tǒng)經(jīng)驗認為，多種菌株的復配可實現(xiàn)效果疊加[27]，硝化細菌與枯草芽孢桿菌復合制劑對草魚(Ctenopharyngodonidellus)養(yǎng)殖水體的凈化效率明顯提高，并優(yōu)化了水體的菌群結(jié)構(gòu)[28]。有些復合益生菌能夠增加水體中微生物種類組成和豐度，提升代謝作用，改良水環(huán)境[29]。然而，本試驗4株菌株的混合液對氨氮降解效果和單一菌株相比無顯著差異，甚至稍弱于單一菌株。本試驗中的菌株均為抑菌型乳酸菌，不同菌株分泌的抑菌物質(zhì)不同，可能由于菌群在系統(tǒng)內(nèi)的競爭，削弱了總體效果。乳酸菌為異養(yǎng)型細菌，利用水體中的有機含氮物質(zhì)，在厭氧或兼性厭氧條件下生長。因此，可考慮與反硝化細菌、光合細菌及芽孢桿菌復配調(diào)控水體。施大林等[30]研究發(fā)現(xiàn)，由光合細菌、芽孢桿菌、乳酸菌、硝化細菌組成的四聯(lián)活菌對氨氮和亞硝酸鹽的降解效率明顯高于單一菌株。由此可見，益生菌組合制劑并非菌種復配越多越好，需要根據(jù)菌株本身特性(如革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，好氧和厭氧或兼性厭氧)及營養(yǎng)源(自養(yǎng)型和異養(yǎng)型)互補需求開展復配研究。本研究為漁源乳酸菌在養(yǎng)殖水環(huán)境的調(diào)控作用及應用提供依據(jù)，然而，乳酸菌對養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)節(jié)與對養(yǎng)殖動物免疫的協(xié)同作用的機理，還需進一步探討。