譚 杰，孫宗紅，陶雅晉，姚高友，劉付少梅，劉錦上，劉志剛

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東省南海經(jīng)濟無脊椎動物健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心， 廣東 湛江 524088； 2.湛江銀浪海洋生物技術(shù)有限公司，廣東 湛江 524000； 3.雷州市源源至水產(chǎn)種苗繁育有限公司，廣東 湛江 524200 )

馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)又稱合浦珠母貝(P.fucata)，在中國主要分布在南海、廣東、廣西、海南及臺灣南部沿海海域[1-2]。該貝是培育海水珍珠的重要經(jīng)濟貝類，其孕育的珍珠稱為“南珠”，在國際珍珠市場占據(jù)重要地位，具有極高的經(jīng)濟價值[3]。

1965年中國首次成功突破馬氏珠母貝人工育苗技術(shù)，隨后南珠產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，至20世紀(jì)90年代，該產(chǎn)業(yè)已成為廣東、廣西和海南等地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展的重要支柱[4]。然而快速發(fā)展的同時，問題也日益突顯。長期的累代養(yǎng)殖、不科學(xué)的育苗方式、頻繁的病害侵?jǐn)_和惡化的生存環(huán)境，使得馬氏珠母貝種質(zhì)退化嚴(yán)重，具體表現(xiàn)為生長速度緩慢、存活率降低、珍珠質(zhì)量和產(chǎn)量下降等[5-6]。目前許多養(yǎng)殖戶因為養(yǎng)殖經(jīng)濟效益低而處于停產(chǎn)觀望狀態(tài)。改良舊品種，培育新品種，克服種質(zhì)退化，促進(jìn)國內(nèi)馬氏珠母貝產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展已成為業(yè)界的共同呼聲。為此，科研工作者開展了馬氏珠母貝品種改良研究，并取得了一定成效。如杜曉東等[7]采用群體和家系選育的方法，獲得了馬氏珠母貝“海選1號”新品種，該品種與未經(jīng)選育的馬氏珠母貝相比，2齡貝平均殼寬和平均殼長分別提高21.2%和20.8%，留核率與珍珠珠層厚度分別提高22.3%和22.2%；何毛賢等[8]經(jīng)6代群體選育，培育出了殼型肥厚、優(yōu)質(zhì)珍珠率高的“南科1號”新品種；喻達(dá)輝等[9]通過家系基因聚合為核心的選擇育種技術(shù)，選育出了生長快、育珠性能優(yōu)良的“南珍1號”新品種。

馬氏珠母貝的殼色具有多態(tài)性，且不同殼色個體在生長速度、育珠性能、存活率等方面存在差異[10]。本課題組以殼色為輔助標(biāo)記，以生長快、存活率高為選育目標(biāo)，采用群體繼代選育的方法開展了馬氏珠母貝紅、黑、黃、白4種殼色新品種培育研究。迄今為止，該貝4種殼色群體已經(jīng)歷8代選育且取得了較理想的選育效果，殼色趨于純化、各經(jīng)濟性狀均優(yōu)于普通群體。但在分子層面上，經(jīng)過8代群體繼代選育后的4種殼色群體遺傳分化程度如何，遺傳差異達(dá)到什么水平，尚未查明。EST-SSR標(biāo)記來源于基因的編碼區(qū)，具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富及共顯性遺傳等特點，能較準(zhǔn)確地反映物種的遺傳多樣性[11-15]。筆者采用10對EST-SSR 引物對馬氏珠母貝4種殼色群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期從分子層面上揭示該貝4種殼色選育系F8的遺傳差異和分化水平，為選育工作提供分子科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

課題組在廣東省湛江市雷州源源至公司經(jīng)8年群體繼代選育獲得馬氏珠母貝紅、黑、白、黃4種殼色群體，每種殼色群體隨機挑選40個健康、有活力的個體，清洗干凈后活體運回廣東南海經(jīng)濟無脊椎動物健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心實驗室，暫養(yǎng)3 d后，取閉殼肌組織置于無水乙醇中-20 ℃保存，用于后續(xù)DNA提取。

1.2 DNA提取及引物篩選

取無水乙醇保存的閉殼肌組織，解凍、剪碎，采用上海生工生物公司Ezup柱式提取試劑盒提取DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，用分光光度計測定DNA的質(zhì)量濃度。檢測合格后用無菌水稀釋至同一質(zhì)量濃度，分裝-20 ℃保存?zhèn)溆?。選取10對擴增效果好的EST-SSR引物用于4種殼色馬氏珠母貝群體遺傳多樣性分析，引物參考文獻(xiàn)[16]，序列信息及退火溫度見表1。EST-SSR引物由上海生工生物公司技術(shù)部合成。

表1 EST-SSR引物序列及退火溫度

1.3 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

10 μL反應(yīng)體系：TaKaRa Taq TM酶(5 U/μL)0.1 μL，10×buffer 1.0 μL，MgCl2(2 mmol/L)0.6 μL， dNTPs(25 mmol/L)0.8 μL，正向引物和反向引物各0.8 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 4.9 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；30次循環(huán)(94 ℃變性30 s，50～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)；72 ℃延伸10 min。

取2 μL PCR擴增產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若有清晰擴增條帶則使用DYY-6C型電泳儀進(jìn)行8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒定電壓150 V，電泳3.5 h)，擴增產(chǎn)物分離后，固定、銀染、顯色、觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Gel-Pro analyzer軟件對聚丙烯酰胺凝膠圖上的等位基因條帶進(jìn)行定位，確定等位基因的大小和基因型；利用Popgene32軟件計算群體的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測雜合度、遺傳相似系數(shù)以及遺傳距離等，同時進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗[17]。使用PIC-CALC軟件計算多態(tài)信息含量；用MEGA 4.1構(gòu)建UPGMA樹[18]。

2 結(jié) 果

2.1 EST-SSR位點的多態(tài)性

10個EST-SSR位點的多態(tài)性參數(shù)見表2。10個位點共檢測到46個等位基因，各位點的等位基因數(shù)為2～7個，平均等位基因數(shù)為4.6個，其中位點PmartE27的等位基因數(shù)最少(2個)，位點PmartE32和PmartE43的等位基因數(shù)最多(7個)；有效等位基因數(shù)為1.0880～5.1939個，平均有效等位基因數(shù)為3.1132個；期望雜合度為0.0812～0.8108，平均期望雜合度為0.6040；觀測雜合度為0.0833～0.9917，平均觀測雜合度為0.5595；多態(tài)信息含量以位點PmartE32為最高，達(dá)到0.7482，位點PmartE29最低，為0.0796，平均多態(tài)信息含量為0.5517，說明10個位點的遺傳多樣性豐富，其中有7個高度多態(tài)位點(多態(tài)信息含量>0.5)，2個中度多態(tài)位點(0.25<多態(tài)信息含量<0.5)和1個低度多態(tài)位點(多態(tài)信息含量<0.25)。

表2 10個EST-SSR位點的遺傳多態(tài)性參數(shù)

2.2 4種殼色馬氏珠母貝群體的遺傳多樣性

4種殼色馬氏珠母貝群體的平均等位基因數(shù)為3.5～4.0，平均有效等位基因數(shù)為2.288～2.730；平均觀測雜合度為0.445～0.627，平均期望雜合度為0.479～0.580，除黃殼色群體外，其余3種殼色群體的觀測雜合度均大于期望雜合度，說明不存在雜合子缺失的情況；Shannon多樣性指數(shù)為0.850～1.042；平均多態(tài)信息含量為0.423～0.509，每種殼色群體多態(tài)信息含量低于0.5的位點為3～6個，低于0.25的位點為1～2個，這與選擇作用有關(guān)，4種殼色群體的多態(tài)性信息含量處于中低等水平。黃殼色群體中位點PmartE33以及白殼色群體中位點PmartE29的平均觀測雜合度、平均期望雜合度和多態(tài)信息含量值均為0，說明這兩個位點在這兩個群體中雜合子缺失嚴(yán)重，基本達(dá)到純合。黃殼色群體中各遺傳參數(shù)值最小，而紅殼色群體中除有效等位基因數(shù)外，其他參數(shù)值等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量和Shannon多樣性指數(shù)均最大，說明紅殼色群體的遺傳多樣性最高，黃殼色群體的遺傳多樣性最低，4種殼色群體總的遺傳多樣性維持在較高水平。

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗

Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果表明，40個群體—位點組合中有31個組合顯著偏離平衡(P<0.05)，占總位點的77.5%。4種殼色群體中均偏離的位點有5個(PmartE10、PmartE23、PmartE26、PmartE35、PmartE38)，在白、黑、黃3種殼色群體中顯著偏離的位點有1個(PmartE32)。紅殼色群體中有6個位點(60%)顯著偏離平衡，白殼色群體中有8個位點(80%)顯著偏離平衡，黑殼色群體有8個位點(80%)顯著偏離平衡，黃殼色群體中有9個位點(90%)顯著偏離平衡。說明人工選擇壓力下，群體基因頻率發(fā)生了改變。

表3 4種殼色馬氏珠母貝群體在10個EST-SSR位點的遺傳多樣性參數(shù)

注：Na：等位基因數(shù)；Ne：有效等位基因數(shù)；Ho：觀測雜合度；He：期望雜合度；I：Shannon多樣性指數(shù)；PIC：多態(tài)信息含量；P：哈溫平衡檢驗；*：顯著偏離哈溫平衡(P<0.05).

2.4 4種殼色馬氏珠母貝群體的遺傳分化

10個EST-SSR位點在4種殼色群體中的遺傳分化指數(shù)為0.0101～0.3025，平均為0.1206(0.05<遺傳分化指數(shù)<0.15)(表4)，說明4種殼色群體間的遺傳分化處于中等水平，這與課題組8年群體繼代選育有關(guān)。各位點的基因流值0.5764～24.5841，除位點PmartE38的基因流值較大外，其位點的基因流值均較小，平均為1.8225，說明4種殼色馬氏珠母貝群體間未發(fā)生基因流動。

表4 4種殼色群體的遺傳分化指數(shù)和基因流值

2.5 4種殼色馬氏珠母貝群體間的遺傳距離和遺傳相似性

4種殼色馬氏珠母貝群體間的遺傳相似系數(shù)為0.7107～0.8418，遺傳距離為0.1742～0.3415，說明4種殼色馬氏珠母貝群體間存在一定的遺傳差異，其中紅殼色群體和黑殼色群體的遺傳相似度最高(0.8418)，遺傳距離最小(0.1722)，白殼色群體和黃殼色群體之間的遺傳相似度最低(0.7107)，遺傳距離最大(0.3415)?；贜ei′s遺傳距離，采用UPGMA法，對種殼色馬氏珠母貝群體進(jìn)行聚類分析(圖1)，結(jié)果顯示4種殼色群體共分為3類，其中紅殼色群體和黑殼色群體最先聚為一類，然后和白殼色群體聚集成一類，最后與黃殼色群體聚為一類。

圖1 4種殼色馬氏珠母貝群體的聚類圖

群體紅殼色白殼色黑殼色黃殼色紅殼色—0.83170.84180.7458白殼色0.1842—0.79490.7107黑殼色0.17220.2296—0.8282黃殼色0.29330.34150.1885—

3 討 論

3.1 4種殼色馬氏珠母貝群體間的遺傳分化

遺傳分化指數(shù)和遺傳距離是衡量群體間遺傳分化程度的兩個重要指標(biāo)，在良種選育過程中，由于人為施加的選擇壓力，基因頻率常常發(fā)生改變，群體間的遺傳分化水平也隨之改變。水產(chǎn)動物中，頡曉勇等[19]采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)分析了吉富品系尼羅羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)9代選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)，得到F0與F6、F7、F8和F9代之間的遺傳分化指數(shù)分別為0.0377、0.0644、0.0609、0.0759，說明隨著選育代數(shù)的增加，吉富品系尼羅羅非魚的遺傳分化程度逐漸變大。陳靜等[10]以RAPD分子標(biāo)記研究了馬氏珠母貝黑、白、紅、黃4種殼色選育系F3的遺傳變異，發(fā)現(xiàn)各殼色選育系間的遺傳分化系數(shù)為0.2143～0.3186，遺傳距離為0.1135～0.1968，大于王愛民等[20]利用RAPD分子標(biāo)記分析的馬氏珠母貝3個不同地理野生群體間的遺傳距離，說明本課題組的馬氏珠母貝F3代殼色選育系的遺傳結(jié)構(gòu)已發(fā)生改變，這與王學(xué)穎等[3]報道的馬氏珠母貝金黃殼色系F3和基礎(chǔ)群體間的遺傳分化系數(shù)一致。白成等[21]利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記，分析了馬氏珠母貝F5代白、黑、黃、紅4種殼色家系的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，4個家系間的遺傳分化系數(shù)值為0.113～0.793，與普通養(yǎng)殖群體及殼色選育系F5相比，4種殼色家系間的遺傳距離變大；朱曉聞等[1]報道馬氏珠母貝F5代4種殼色選育系群體在10個微衛(wèi)星位點處的平均遺傳分化系數(shù)為0.0445，遺傳分化程度較小，遺傳距離為0.0629～0.1729；本研究中，紅、白、黑、黃4種殼色群體間的遺傳分化系數(shù)為0.0101～0.3025，平均值為0.1206，遺傳距離為0.1722～0.3415，與選育系F5代相比，F(xiàn)8代4種殼色群體間的遺傳距離和遺傳分化程度增大，遺傳變異提高，群體遺傳結(jié)構(gòu)改變明顯，這是多年定向選育的結(jié)果。

3.2 人工選育對馬氏珠母貝4種殼色群體遺傳多樣性的影響

遺傳多樣性是良種選育的基礎(chǔ)和前提，因此，進(jìn)行遺傳選育改良時要盡可能的維持選育群體的遺傳多樣性，預(yù)防經(jīng)濟性狀衰退，以獲得高品質(zhì)的新品種。本研究中，4種殼色馬氏珠母貝群體的平均等位基因數(shù)為4.5，其中紅、黑、白、黃4種殼色群體的等位基因數(shù)分別為4.0、3.7、3.6、3.5，其值均小于平均水平，說明每種殼色群體均存在等位基因丟失的現(xiàn)象且黃殼色群體丟失最嚴(yán)重，這與本課題組多年定向選育有關(guān)。因人工選育導(dǎo)致等位基因丟失的現(xiàn)象在鱖魚(Sinipercachuatsi)[22]、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)[23]、長牡蠣(Crassostreagigas)[24]、大珠母貝(Pinctadamaxima)[25]和仿刺參(Apostichopusjaponicus)[26]等水產(chǎn)動物群體中均有報道。有文獻(xiàn)資料顯示，馬氏珠母貝普通養(yǎng)殖群體的觀測雜合度為0.15～0.56，期望雜合度為0.38～0.75。朱曉聞等[1]報道殼色選育系F5代的期望雜合度為0.662～0.685，多態(tài)信息含量為0.6025～0.6230。本研究中，4個群體的觀測雜合度和期望雜合度分別為0.445～0.627和0.479～0.580，除黃殼色群體外，其余3種殼色群體的觀測雜合度均大于期望雜合度，說明這3個群體受人工選育的影響小，遺傳多樣性較豐富。與馬氏珠母貝普通養(yǎng)殖群體相比，4種殼色群體的觀測雜合度和期望雜合度處于中等水平，兩者之間存在一定的差異，出現(xiàn)差異一方面與人工施加的選擇壓力有關(guān)，另一方面與所選取位點的變異程度不同有關(guān)。與選育系F5相比，F(xiàn)8的期望雜合度和多態(tài)信息含量均降低，說明經(jīng)過8代選育4種殼色馬氏珠母貝群體的遺傳多樣性降低，但總體仍處于較高水平。這與選育時選取的方法有關(guān)，本研究采用群體繼代選育的方式確保了有效繁育群體的數(shù)量，減少了近交衰退幾率。這與聶鴻濤等[27]報道的菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)人工選育群體及田野等[28]報道的泥蚶(Tegillarcagranosa)人工選育群體遺傳多樣性變化的趨勢極相似。因此，在今后的選育工作中，應(yīng)注重親本群體的數(shù)量，盡可能避免親緣近交，實現(xiàn)種質(zhì)資源的健康可持續(xù)發(fā)展。