劉紅祥，孔憲好，鐘聲

(青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266000)

近年來(lái)，畜牧業(yè)在國(guó)家調(diào)控政策及市場(chǎng)需求影響下得到快速發(fā)展，但隨著世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，疾病對(duì)養(yǎng)殖危害也隨之加劇，某些常規(guī)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)不能適應(yīng)行業(yè)快速發(fā)展需求，伴隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，ELISA技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作步驟簡(jiǎn)單快捷、安全性高、污染少等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越應(yīng)用廣泛，在疾病診斷、免疫效果評(píng)價(jià)方面具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 ELISA原理

1.1 使抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，并保持其免疫活性。

1.2 使抗原或抗體與酶結(jié)合成酶標(biāo)抗原或抗體，并保持抗原或抗體的免疫活性和酶的活性。

1.3 酶標(biāo)的抗原或抗體與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶催化底物形成水解、氧化或還原反應(yīng)，形成有色物質(zhì)，顏色的深淺與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或半定量分析。

2 ELISA方法

2.1 方法一：雙抗體夾心法 其步驟見(jiàn)圖1。

圖1 雙抗體夾心法

2.1.1 固相載體包被的是特異性抗體或抗原，多數(shù)檢測(cè)的是抗原為主，大分子抗原應(yīng)用較多,如家禽的P27抗原檢測(cè)（IDEXX)。

2.1.2 顏色反應(yīng)為有明顯顏色為陽(yáng)性。

2.2 方法二：間接法 其步驟見(jiàn)圖2。

圖2 間接法

2.2.1 固相載體包被的是特異性的抗原，檢測(cè)的是抗體，如目前家禽傳染性支氣管炎（IB）、呼腸孤（REO）、傳染性法氏囊（IBD）、雞毒支原體（MG）、滑液囊支原體（MS）、禽肺病毒感染（APV）、禽腦脊髓炎（AE）的 ELISA 抗體；家畜藍(lán)耳?。≒RRSV）、豬圓環(huán)病毒病PCV2、口蹄疫（FMD）的ELISA抗體等。

2.2.2 顏色反應(yīng)為有明顯顏色為陽(yáng)性，且顏色的深淺可以反應(yīng)抗體的高低。

2.3 方法三：競(jìng)爭(zhēng)法 其步驟見(jiàn)圖3。

圖3 竟?fàn)幏?/p>

2.3.1 固相載體包被的是特異性的抗體或抗原，可以檢測(cè)抗體也可以檢測(cè)抗原。如家畜中豬瘟抗體，偽狂犬GB/GI抗體等。

2.3.2 顏色反應(yīng)為有明顯顏色為陰性，反之為陽(yáng)性。

3 ELISA操作注意事項(xiàng)

3.1 實(shí)驗(yàn)前注意要點(diǎn)

3.1.1 移液器、滴頭 移液器定期及時(shí)校正，保證微量加樣的準(zhǔn)確性；滴頭一次性使用。

3.1.2 試劑盒的預(yù)溫 實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～25℃的前提下，提前2h預(yù)溫，保證試劑盒中的各組分溫度均一。

3.1.3 洗液的配制 根據(jù)試劑盒的要求提前進(jìn)行稀釋且使用時(shí)恢復(fù)至室溫，如IDEXX 10*。

3.1.4 血清樣品的預(yù)處理 血清保證新鮮，2～8℃保存不超過(guò)7d；長(zhǎng)期保存需冷凍，避免反復(fù)凍融以免影響效價(jià)；血樣溶血勿用，紅細(xì)胞釋放的具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)可造成非特異性的顯色反應(yīng)；血樣盡量無(wú)菌以免產(chǎn)生假陽(yáng)性；解凍后血清要輕柔顛倒混勻，避免強(qiáng)烈震蕩，如渾濁要離心取上清使用。

3.1.5 血清樣品稀釋 根據(jù)試劑盒的要求對(duì)血樣進(jìn)行相應(yīng)的稀釋?zhuān)ㄈ纾呵?500倍，豬2倍、5倍、40倍、100 倍）。

特別注意取樣時(shí)要準(zhǔn)確且滴頭外壁的殘留血清要剔除，加樣后要切記混勻。

500倍稀釋方法見(jiàn)以下三步：

第一步：10μl血清加入到 90μl的稀釋液（10倍）；第二步：取10倍稀釋的樣品加入到 90μl的稀釋液（100倍）；第三步：取 100倍稀釋的 20μl的樣品加入到80μl的稀釋液中（500倍）。

3.2 實(shí)驗(yàn)中注意的要點(diǎn)

3.2.1 加樣 稀釋好的樣品加入時(shí)懸空或不貼底壁，加樣在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁的上部，加入過(guò)程中不可產(chǎn)生氣泡，保證每孔中液體相同。

3.2.2 孵育 保證孵育溫度的適宜，ELISA板不要直接在溫度偏低的試驗(yàn)臺(tái)面上孵育，還要加蓋或封膜板。

3.2.3 洗滌 稀釋好的洗液室溫下洗板且不能溢出，每次洗板的過(guò)程中要垂直甩板，甩干凈且在反應(yīng)孔沒(méi)有干的情況下加入下一步試劑，試驗(yàn)操作中避免手接觸反應(yīng)板底部，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.2.4 酶標(biāo)抗體、底物、終止液 酶標(biāo)抗體剩余不能倒回原瓶，底物應(yīng)避光使用。

3.2.5 酶標(biāo)儀讀數(shù) 酶標(biāo)儀提前15min開(kāi)啟，且加完終止液后15min內(nèi)讀數(shù)，正確使用相應(yīng)波長(zhǎng)濾光片且定期校正檢查濾光片。