朱德財 胡曉晴 趙 桐 田 晶 張 勇 劉雪梅

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

纖維素作為世界上儲存量最大的有機物已被人類充分利用，是植物細(xì)胞壁的主要成分，自然界每年有1 800億噸的纖維素生成[1]。從1996年，Delmer小組首次從植物中克隆出纖維素合成酶基因(Cellulose Synthase/CESA)以來，已經(jīng)在很多物種中分離得到了纖維素合成酶基因，如在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中得到了10個CESA基因，水稻(Oryzasativa)中含有10個CESA基因[2～3]等。纖維素的合成主要是在纖維素合成酶復(fù)合體(Cellulose Synthesis Complex，CSC)中完成，而纖維素合成酶在纖維素合成中起主導(dǎo)作用[4]。目前的研究結(jié)果認(rèn)為3個CESA基因形成一個有功能的纖維素合成酶復(fù)合體[5]，擬南芥的CESA4、CESA7和CESA8主要負(fù)責(zé)次生細(xì)胞壁的纖維素合成，初生細(xì)胞壁纖維素的合成是由CESA1、CESA3和CESA6及其類似基因CESA2、CESA5、CESA9完成[2,6～12]。水稻中CESA4、CESA7、CESA9突變體顯示水稻的莖和葉變脆且容易折斷，并且纖維素含量下降。以上的結(jié)果表明纖維素合成酶基因在植物細(xì)胞壁的形成和植物的生長發(fā)育過程中具有關(guān)鍵的作用。

啟動子是位于基因上游的5′端能夠與RNA聚合酶識別與結(jié)合的一段特異的非編碼DNA序列[13～14]。它能夠決定基因的時空表達特異性與基因的表達強度，在基因行駛功能中起到關(guān)鍵作用，主要由核心啟動區(qū)、上游元件和應(yīng)答元件組成。組織特異性啟動子能夠調(diào)控外源基因在特定的組織或器官中進行表達，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，同時避免了植物體內(nèi)營養(yǎng)不必要的浪費，目前在植物的根、莖、葉、花、果實、種子等組織器官中都克隆得到了組織特異性啟動子[15]。對基因啟動子的研究能夠為揭示基因的功能提供一個新的方法，所以近年來成為研究的重點和熱點。

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)屬樺木科(Betulaceae)樺木屬(Betula)，為喜光、適應(yīng)性強、耐貧瘠、耐嚴(yán)寒和喜酸性土壤的落葉喬木[16]，具有重要的生態(tài)和商業(yè)價值。在造紙行業(yè)中纖維素含量是關(guān)于紙張品質(zhì)好壞的重要依據(jù)，所以研究白樺纖維素合成酶基因?qū)τ诎讟宓拈_發(fā)利用具有重要的意義。本研究克隆得到了BpCESA7基因的啟動子序列并對其序列進行了生物信息學(xué)分析，最后將得到的啟動子序列構(gòu)建到植物表達載體pBI121-GUS，分別對野生型白樺和擬南芥進行侵染并GUS染色分析其表達特征。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 植物材料

野生型白樺及擬南芥均由本實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑

總DNA提取試劑盒與膠回收純化試劑盒均購自于天根公司；高保真酶購自于東洋紡公司；限制性內(nèi)切酶與T4連接酶均購自于NEB公司；35s-pBI121-GUS表達載體由本實驗室保存；pMD18-T購自于Invitrogen公司；Na2EDTA購自于天津市永大化學(xué)試劑有限公司；K3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]購自于博迪化工股份有限公司；Triton-100購自于河南納川生物技術(shù)有限公司；X-GLUC購自于Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 白樺基因組總DNA的提取

以本實驗室保存的白樺組培苗為材料提取白樺基因組總DNA。

1.2.2 目的片段的克隆

根據(jù)白樺基因組信息(http://birch.genomics.cn/page/species/index.jsp)設(shè)計引物并擴增白樺BpCesA7基因上游2 000 bp的基因序列，并由哈爾濱適合生物科技有限公司合成。其中上游引物序列：BpCesA7-promoterF：TCTCAAAATTATCAAGAGGGG；下游引物序列：BpCesA7-promoterR：ATCAATGAGGTGAGGTGGT。PCR反應(yīng)體系如下：2.5 μL總DNA、5 μL 10×PCR Buffer、上下游引物各1.25 μL、3 μL 2.5 mmol·L-1MgSO4、31 μL無菌水、5 μL 2 mmol·L-1dNTPs以及1 μL KOD-Plus-Neo，總體積50 μL。PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)。目的片段回收、純化后與pMD18-T克隆載體16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR篩選獲得陽性克隆，送至哈爾濱適合生物科技有限公司測序。

1.2.3 啟動子序列分析

利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析軟件，對克隆得到的BpCesA7基因啟動子序列進行元件分析。

1.2.4 植物表達載體構(gòu)建

根據(jù)BpCesA7基因啟動子序列設(shè)計酶切引物，F(xiàn):CCATCGATTCTCAAAATTATCAAGAGGGG(下劃線標(biāo)記為ClaⅠ酶切位點)，R:CGGGATCCATCAATGAGGTGAGGTGGT(下劃線標(biāo)記為BamHⅠ酶切位點)。從1.2.2中獲得的陽性克隆菌株中提取質(zhì)粒稀釋100倍后用酶切引物進行PCR，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與1.2.2中基本相同只是在反應(yīng)程序中退火溫度由60℃變?yōu)?2℃。擴增產(chǎn)物純化回收后，分別將目的片段和植物表達載體pBI121-GUS進行ClaⅠ和BamHⅡ雙酶切，回收純化的目的片段和植物表達載體通過T4DNA連接酶過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性篩選和菌落PCR檢測獲得陽性克隆，提取陽性重組質(zhì)粒DNA，進行PCR鑒定，獲得重組植物表達載體，命名為proBpCESA7-121-GUS。

1.2.5 菌液的制備及瞬時轉(zhuǎn)化

通過凍融法將proBpCESA7-121-GUS表達載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105中。挑取農(nóng)桿菌單菌落在5 mL的LB液體培養(yǎng)基(加入相應(yīng)的抗生素)中28℃過夜培養(yǎng)，次日上午取1 mL該菌液加入到新鮮的100 mL LB液體培養(yǎng)基(加入相應(yīng)的抗生素)中再進行培養(yǎng)，待菌液至OD600為0.6～0.7時，6 000 r·min-1離心15 min收集菌體，用于擬南芥和白樺的瞬時侵染。擬南芥轉(zhuǎn)化方法參照郭勇等[17]，白樺轉(zhuǎn)化方法參見李萌等[18]。每個試驗取10個植株，重復(fù)3次。

1.2.6 GUS染色測定

X-GLUC染色液配制(100 mL)：200 mmol·L-1的pH=7.0的磷酸緩沖液50 mL；100 mmol·L-1的Na2EDTA溶液10 mL；5 mmol·L-1的K3[Fe(CN)6]10 mL；5 mmol·L-1的K4[Fe(CN)6]10 mL；0.1% Triton-100；X-GLUC 60 mg，然后加水定容至100 mL。

用無菌水洗凈侵染處理后的擬南芥和白樺將其分別放入50 mL離心管中，各加入GUS染色液浸沒植株，37℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗染色24～36 h，取出用無菌水洗凈，樣品用V(乙醇)∶V(乙酸)=3∶1脫色液脫色8 h，前兩小時每半小時換脫色液一次，然后取出用無菌水洗凈，觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.7 徒手切片方法

本實驗對白樺莖徒手切片方法參照朱登峰等[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺BpCesA7基因上游序列的獲得

以白樺總DAN為模板PCR擴增，電泳結(jié)果顯示在2 000 bp處有清晰單一條帶，與預(yù)期片段大小相近。純化回收后克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR方法鑒定陽性克隆，隨機選取3個送至哈爾濱適合生物科技有限公司測序比對后顯示與在白樺基因組中查找的序列一致，說明我們成功克隆得到了目的基因。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖譜 M. DL-2000 Marker；1.PCR產(chǎn)物Fig.1 Electrophoretogram of PCR product M. DL-2000 Marker; 1. PCR product

2.2 白樺BpCesA7基因啟動子序列分析

利用PLACE和PlantCARE在線軟件對啟動子序列進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動子序列中除了含有基本轉(zhuǎn)錄元件TATA-box、CAAT-box，同時還含有其它多種作用元件。其中包括7種光響應(yīng)元件(ACE、BOX4、BOXI、G-box、GT1-box、sp1、boxⅡ)，5種激素響應(yīng)元件(ABRE、ERE、TGA-element、TGACG-motif、CGTCA-motif)，2種關(guān)于葉片形態(tài)發(fā)育元件(HD-Zip1，HD-Zip2)，1種熱激反應(yīng)元件(HSE)等，因為纖維素是細(xì)胞壁的主要成分，而細(xì)胞壁在植物抵御生物與非生物脅迫等其他的生物過程中起到關(guān)鍵作用，所以由此推測BpCesA7啟動子在植物生長發(fā)育過程中起到了關(guān)鍵作用。具體元件及其功能和部分元件位置如表1所示。

2.3 植物表達載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物和35s-pBI121-GUS載體質(zhì)粒分別進行ClaⅠ和BamHⅠ雙酶切。連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取8個單菌落進行PCR檢測。結(jié)果顯示在2 000 bp處有清晰條帶(圖2)。提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗證條帶大小與預(yù)期相同(圖3)，經(jīng)測序比對后驗證連接正確，植物表達載體proBpCesA7-pBI121-GUS構(gòu)建成功。

2.4 白樺BpCesA7基因啟動子在白樺中的表達活性

為了研究BpCesA7啟動子在白樺中的表達特征我們將構(gòu)建好的proBpCESA7-pBI121-GUS和35s-pBI121-GUS表達載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到白樺組培苗中，并通過GUS染色觀察其表達特征。結(jié)果顯示35 s啟動子驅(qū)動的GUS基因在白樺苗中全組織表達沒有差異，BpCESA7啟動子驅(qū)動的GUS基因在白樺根、莖、葉中都觀察到了GUS活性(圖5A)，并且在葉和根中顏色較深表明其在根和葉中表達量較高(圖5B,C)，并且其存在組織表達特異性。對白樺莖進行徒手切片顯示BpCESA7啟動子驅(qū)動的GUS基因主要在周皮和木質(zhì)部表達(圖5D)，說明BpCESA7基因在白樺抵御生物與非生物脅迫中起到了一定作用。沒有進行轉(zhuǎn)化的白樺野生型幼苗未檢測到GUS活性。

表1 啟動子順式作用元件分析Table 1 Analysis of promoter elements

圖2 白樺BpCESA7基因啟動子序列Fig.2 Promoter sequence of BpCESA7 gene for B.platyphylla

圖3 大腸重組質(zhì)粒的PCR檢測 M. DL-2000 Marker；1～8.陽性鑒定產(chǎn)物Fig.2 PCR result of positive E.coli clone M. DL-2000 Marker; 1-8. Positive identification product

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 M. DL-15000 Marker；1.雙酶切產(chǎn)物Fig.4 The result of double digestion M. DL-15000 Marker; 1. Double digest product

2.5 白樺BpCesA7基因啟動子在擬南芥中的表達活性

將帶有35 s啟動子和BpCESA7啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化到蓮座葉時期和開花時期擬南芥中，經(jīng)過GUS染色結(jié)果顯示在蓮座葉時期擬南芥中全都表達(圖5E)并且BpCESA7啟動子驅(qū)動的GUS著色較35 s啟動子驅(qū)動的GUS著色深，表明BpCESA7啟動子在擬南芥中具有轉(zhuǎn)錄活性，并且蓮座葉時期表達量較高，在此時期可能起到了關(guān)鍵作用。在開花時期(圖5F)染色結(jié)果顯示在擬南芥的根，葉，萼片，雌蕊中都有表達，并且在根中的染色最深(圖5G～K)，表明其在根的表達量高于其他部位，說明BpCESA7基因除了在營養(yǎng)生長中起到了關(guān)鍵作用同時在生殖生長中也具有一定作用。以上結(jié)果也說明BpCESA7啟動子具有啟動子活性。

3 討論

纖維素在人類生活中具有重要的作用和人類的生活息息相關(guān)，探究纖維素合成基因的表達特征對于研究纖維素合成具有重要的現(xiàn)實意義。纖維素合成酶(CESA)是合成纖維素的關(guān)鍵酶，本研究通過PCR技術(shù)克隆得到了白樺纖維素合成酶基因CESA7的啟動子并對其序列進行了分析，同時通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法在白樺以及擬南芥中的表達模式進行了分析。

啟動子中的順式作用元件對于基因的時空表達及表達量具有重要的調(diào)控作用[13～14]，BpCESA7啟動子中除了含有高等植物具有的共有元件之外還含有多種不同順式作用元件，例如光響應(yīng)元件(ACE、BOX4、BOXI、G-box、GT1-box、sp1、boxⅡ)、激素響應(yīng)元件(ABRE、ERE、TGA-element、TGACG-motif、CGTCA-motif)、關(guān)于葉片形態(tài)發(fā)育元件(HD-Zip1，HD-Zip2)、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)順式作用元件(TC-rich repeats)、熱激反應(yīng)元件(HSE)等。由以上結(jié)果推測BpCESA7基因?qū)τ谥参锏纳L發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。并且研究BpCESA7啟動子元件為揭示BpCESA7基因功能具有重要參考價值。

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將含有BpCESA7啟動子序列的表達載體轉(zhuǎn)到白樺與擬南芥中，結(jié)果顯示在白樺的莖、葉中檢測到了GUS活性。這與Liu等[20]研究BpCESA7在莖和葉中表達量高度相同，同時我們也在根中檢測到了GUS活性。對莖進行徒手切片結(jié)果顯示其主要在木質(zhì)部和周皮表達，擬南芥AtCESA7[9]和亞麻LuCESA7[21]均被證實是關(guān)于次生細(xì)胞壁形成的基因，水稻OsCESA7[22]突變體表現(xiàn)出纖維素含量下降的特征是纖維素合成的關(guān)鍵基因，以上結(jié)果證明BpCESA7可能也是關(guān)于次生細(xì)胞壁的形成和纖維素的合成。對擬南芥花的染色結(jié)果顯示在萼片和雌蕊中檢測到GUS活性，這與Liu等[20]BpCESA7在白樺雌花中表達這一結(jié)果相似，并且水稻OsCESA4[23]在水稻雌蕊中表達，以上結(jié)果表明BpCESA7可能參與花發(fā)育過程。同時在擬南芥和白樺的葉片中都檢測到了GUS活性，Liang等[24]研究表明在擬南芥葉片中擬南芥AtCESA7參與蒸騰效率的控制，猜測BpCESA7可能也會參與到蒸騰作用中。對于BpCESA7基因啟動子研究顯示BpCESA7基因在植物生長發(fā)育過程中具有不同的時空表達模式，可能參與不同的生物學(xué)過程，具體功能還需進一步實驗驗證。

對于BpCESA7啟動子的研究為探究其功能提供了新的思路。本研究旨在為研究白樺纖維素合成機制奠定基礎(chǔ)。

圖5 proBpCESA7在擬南芥和白樺中的活性分析 A～D.白樺組織(A.白樺組培苗，B.葉，C.根，D.莖及切片)；E～K.擬南芥組織(E.蓮座期，F(xiàn).開花期，G.莖，H.葉，I.花，J.花器官，K.根)Fig.5 Activity analysis of proBpCESA7 A.thaliana and B.platyphylla A-D. Birch tissue(A. Birch tissue culture seed, B. Leaf, C. Root, D. Stem and slice); E-K.Arabidopsis tissue(E. Rosette, F. Flowering, G. Stem, H. Leaf, I. Flower, J. Floral organ, K. Root)

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