劉美佳 于怡琳 姜 森 張 翔 劉迪秋 葛 鋒

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500)

珠子參(Panaxjaponicus)為五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)植物，因根莖節(jié)間纖細(xì)，節(jié)膨大成球形念珠狀而得名，其根莖入藥。珠子參作為藥材，始載于《滇南本草》，為歷版《中國藥典》收載品種。藥用珠子參主產(chǎn)于云南，屬名貴常用中藥材，是彝族、納西族、白族、藏族、僳族等少數(shù)民族的傳統(tǒng)用藥。珠子參性味苦、甘、微寒，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有補(bǔ)肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛，止血之功效，臨床上應(yīng)用于氣陰兩虛，煩熱口渴，虛癆咳嗽，跌打損傷，關(guān)節(jié)疼痛，咳血，吐血，外傷出血等癥狀[1～2]。

珠子參皂苷(Panaxjaponicussaponins)為珠子參的主要活性成分，主要由達(dá)瑪烷型三萜皂苷和齊墩果烷型三萜皂苷構(gòu)成。目前，已從珠子參根莖葉中分離出了40多種皂苷成分，主要包括竹節(jié)參皂苷Ⅳa、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、竹節(jié)參皂苷Ⅴ、人參皂苷R0、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb1等[3～5]。與珠子參同為人參屬的“人參”(Panaxginseng)主要含達(dá)瑪烷型皂苷，齊墩果烷型皂苷僅發(fā)現(xiàn)含量極微的人參皂苷R0；而“三七”(Panaxnotoginseng)只含達(dá)瑪烷型皂苷，不含齊墩果烷型皂苷[6～7]。珠子參所含皂苷組分與同屬“人參”、“三七”相比，在成分種類以及各組分含量上均存在明顯差異，因其含有大量齊墩果烷型皂苷，導(dǎo)致臨床上用途與人參、三七差別較大[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，珠子參皂苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、改善心肌缺血、增加腦血流量、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及治療白細(xì)胞減少癥等功效[9～10]。

珠子參皂苷主要由甲羥戊酸(MVA)途徑合成[11～12]。近年來，與珠子參親緣關(guān)系較近的人參、三七中的皂苷合成途徑上游、中游路徑已基本清楚，下游的皂苷骨架后修飾過程也在逐步獲得解析[13]。通過MVA途徑合成珠子參皂苷的過程如下：首先，乙酰輔酶A在乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶(AACT)，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)的催化作用下合成了甲羥戊酸(MVA)[14]。隨后，異戊烯基焦磷酸(IPP)及二甲丙烯基焦磷酸(DMPP)在法呢基焦磷酸(FPS)的催化下形成法呢基焦磷酸(FPP)，同時FPP在鯊烯合成酶(SS)及鯊烯環(huán)氧酶(SE)的催化下生成2,3-氧化鯊烯，它是三萜皂苷及植物甾醇等物質(zhì)的共同前體物質(zhì)。2，3-氧化鯊烯由達(dá)瑪烯二醇合酶(DS)催化進(jìn)入達(dá)瑪烷型皂苷合成支路，同時，經(jīng)由β-香樹脂合成酶(β-AS)催化，進(jìn)入齊墩果烷型皂苷合成支路(圖1)。

圖1 珠子參皂苷及植物甾醇生物合成途徑 HMGR. 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶；FPS.法呢基焦磷酸合成酶；SS.鯊烯合成酶；SE.鯊烯環(huán)氧酶；DS.達(dá)瑪烯二醇合成酶；AS.香樹脂合成酶；CAS.環(huán)阿屯醇合成酶；GT.葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；P450.細(xì)胞色素P450Fig.1 The synthesis pathway of P.japonicus saponins and plant sterols HMGR. 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase; FPS. Farnesyl-pyrophosphate synthase; AS. Amysyrin synthase; SS. Squalene synthase; SE. Squalene epoxidase; DS. Dammarenediol-Ⅱ synthase; CAS. Cycloartenol synthase; GT. Glucosyl transferase; P450. Cytochromes P450

在植物三萜皂苷合成途徑中，F(xiàn)PS可能是關(guān)鍵酶之一，F(xiàn)PS不僅在植物基本的生命活動中起著重要作用，而且對泛醌、甾醇、植保素、甾醇、三萜類、黃酮類等代謝產(chǎn)物的積累量也起著重要作用。在擬南芥中如果同時敲除法呢基焦磷酸合酶基因FPS1和FPS2，將會引起植株死亡[15]。Yang等人的研究表明通過調(diào)控FPS基因的表達(dá)，可以影響人參屬植物三七皂苷的生物合成[16]；此外，也有研究證明過表達(dá)人參皂苷合成途徑中關(guān)鍵酶基因會導(dǎo)致人參皂苷積累量的變化[17]。由于珠子參與人參、三七同屬，因此對珠子參皂苷生物合成中關(guān)鍵酶基因進(jìn)行調(diào)控也可能會影響珠子參皂苷的合成。本研究選取珠子參皂苷生物合成途徑中酶基因PjFPS為研究對象，在珠子參細(xì)胞中過表達(dá)該基因從而明確PjFPS的功能及其在皂苷合成過程中的地位，為獲得高效、穩(wěn)定的珠子參皂苷合成調(diào)控技術(shù)提供理論參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料珠子參來源于云南省玉龍縣，經(jīng)云南大學(xué)虞泓教授鑒定為珠子參(Panaxjaponicus)，本研究所用的珠子參材料是本實(shí)驗(yàn)室從珠子參藥用部位誘導(dǎo)并培養(yǎng)的珠子參愈傷組織。研究中所用的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1及植物過表達(dá)載體pCAMBIA2300s均由本實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)中用到的克隆載體pGEM-T和M-MVL逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購買于Promega公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 珠子參RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

采用兩步法提取珠子參總RNA。首先通過改良的異硫氰酸胍法進(jìn)行初提，隨后通過酚和氯仿抽提以及DNA酶消化處理后，獲得純度較好的珠子參總RNA[18]。cDNA第一鏈的合成利用M-MVL逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成，將獲得的cDNA置于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PjFPS基因的克隆

為獲得珠子參皂苷合成途徑中關(guān)鍵酶PjFPS基因序列，本研究根據(jù)NCBI上公布的人參(AGV26444.1)、三七(AHZ59734.1)FPS基因的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域作為模板設(shè)計PjFPS基因的特異性引物為PjFPS-BamHⅠ-F：5′-CGCGGATCCGGTACCAGAATGAGCGATCTGAAGACGAG-3′，PjFPS-PstⅠ-R：5′-TGCACTGCAGTCTAGAACAGACAACAACTTCCCCTCCAT-3′。克隆體系為：cDNA模板5.0 μL，10×Buffer：5.0 μL，Extaq酶：0.5 μL，dNTPs：4.0 μL，10 μmol·L-1的上下游引物：0.5 μL，Nuclease-free water：34.5 μL，總體系為50.0 μL。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入32個循環(huán)(95℃，30 s；56℃，30 s；72℃，1 min 10 s)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min。利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對所得目的基因片段進(jìn)行提取與純化，并將其與克隆載體pGEM-T進(jìn)行連接，篩選陽性菌株并測序，最終獲得珠子參生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因PjFPS的cDNA序列。菌液測序和引物合成均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.3PjFPS基因過表達(dá)載體的構(gòu)建及陽性細(xì)胞系的抗性初篩

通過BamHⅠ和PstⅠ兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行過表達(dá)重組載體pCAMBIA2300s-PjFPS的構(gòu)建。運(yùn)用熱激轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選陽性菌株。運(yùn)用液氮凍融法將上述陽性菌種的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，同時將上述農(nóng)桿菌侵染普通的珠子參細(xì)胞從而獲得PjFPS轉(zhuǎn)基因珠子參陽性株系。

提取生長狀態(tài)良好的9株P(guān)jFPS轉(zhuǎn)基因珠子參陽性系的基因組DNA，并以卡那霉素抗性基因nptⅡ?yàn)槟康臈l帶進(jìn)行擴(kuò)增，其中nptⅡ的特異性引物如下：nptⅡ-F：5′-CTCTGATGCCGCCGTGTT-3′，nptⅡ-R：5′-CCCTGATGCTCTTCGTCCA-3′。PCR檢測反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如下：基因組DNA模板：1.5 μL，10×EasyTaq Buffer：2.0 μL，dNTPs：1.5 μL，DNA Polymerase：5.0 μL，10 μmol·L-1的上下游引物：0.2 μL，Nuclease-free water：14.5 μL，總體積為20.0 μL。PCR條件如下：95℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入32個循環(huán)(95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 2 min)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物則通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.4轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞系的熒光定量分析及FPS酶活測定

PjFPS基因的表達(dá)水平通過熒光定量PCR檢測。轉(zhuǎn)基因珠子參陽性株系RNA的提取和純化與上述方法相同。本實(shí)驗(yàn)涉及特異性引物如下：18srRNA-F：5′-AACCATAAACGATGCCGACCAG-3′，18srRNA-R：5′-TTCAGCCTTGCGACCATACTCC-3′；qFPS-F：5′-ACAGACAACAACTTCCCCTCCAT-3′，qFPS-R：5′-AGAATGAGCGATCTGAAGACGAG-3′。整個反應(yīng)通過GoTaq?2-Step RT-qPCR System(Promega,USA)完成，具體程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性30 s，45個循環(huán)(94℃變性5 s，60℃退火反應(yīng)30 s，72℃延伸30 s)。

通過改良的紫外分光光度計測定法測定轉(zhuǎn)基因珠子參陽性株系的酶活。通過由0.1 mol·L-1蔗糖，0.05 mol·L-1氯化鈉，0.04 mol·L-1磷酸二氫鉀，0.03 mol·L-1EDTA鈉鹽構(gòu)成的Buffer A以及加入0.02 mol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)的Buffer A的Buffer B提取珠子參可溶性PjFPS的微粒體蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法測定提取的PjFPS微粒體蛋白的濃度，用紫外分光光度計在350 nm處測定了空白對照及上述轉(zhuǎn)基因樣品的吸光度，具體操作如下：向比色皿中加入100.0 μL NADPH，10.0 μL蛋白提取液，用適量反應(yīng)緩沖液溶液補(bǔ)齊至1 000.0 μL，同時在測量樣本吸光度時還需要加入50.0 μL牦兒基焦磷酸(GPP)啟動反應(yīng)。并根據(jù)下列公式[酶活(μmol·mg-1)·min-1]=[(△350/min樣品-△350/min空白)/(12.44×V×M)-1]進(jìn)行PjFPS酶活的測定。

1.2.5轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞的皂苷含量及植物甾醇含量測定

準(zhǔn)確稱取珠子參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品粉末10.0 mg，用適量甲醇進(jìn)行溶解。以吸光值為橫坐標(biāo)，以珠子參總皂苷含量為縱坐標(biāo)，繪制珠子參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞系的粉末用適量甲醇溶液溶解，超聲提取法獲得珠子參+總皂苷的粗提物，利用HPD100大孔樹脂獲得純度較好的珠子參皂苷。以香草醛—高氯酸—冰乙酸顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定上述轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞系的總皂苷含量。

稱取干燥至恒重的轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞系粉末1.0 g，以石油醚作為溶劑，以氫氧化鉀—乙醇溶液的皂化反應(yīng)、正己烷萃取為基礎(chǔ)，通過索式提取方式獲取轉(zhuǎn)基因珠子參陽性細(xì)胞系的植物甾醇提取物。根據(jù)乙酸酐—濃硫酸的顯色反應(yīng)測定了植物甾醇的含量，并以吸光值為橫坐標(biāo)，植物甾醇濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行植物甾醇的含量的計算。

1.2.6 統(tǒng)計分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均來源于三組獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)這三組重復(fù)試驗(yàn)計算標(biāo)準(zhǔn)差平均值。根據(jù)T檢驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因株系和對照組之間顯著性差異的測量參數(shù)用星號(*P<0.05；**P<0.01)表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PjFPS轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞系的獲得

本實(shí)驗(yàn)采用同源克隆法，成功克隆得到珠子參FPS基因，命名為PjFPS，提交到NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得的登錄號為KP684141。該基因的cDNA序列包含一個1 200 bp的開放閱讀框，編碼342個氨基酸。PjFPS基因編碼蛋白的分子質(zhì)量39.7 kD，同時具有聚戊烯基合酶家族(Accession：IPR000092)和類異戊二烯合酶(Accession：IPR008949)功能結(jié)構(gòu)域的特異性識別序列。PjFPS的獲得，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。通過農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化操作，本研究獲得了9株具有抗性的轉(zhuǎn)PjFPS細(xì)胞系，提取陽性細(xì)胞系的基因組DNA，以nptⅡ-F和nptⅡ-R為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所有細(xì)胞系在大約450 bp處均有與預(yù)期大小一致的特異性條帶(圖2)。由于1號的生長狀態(tài)較差并且6號轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的特異擴(kuò)增條帶并不明顯，存在假陽性細(xì)胞系的可能性，因此在熒光定量，酶活測定等后續(xù)實(shí)驗(yàn)中只針對剩下的7株轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞系開展研究，依次編號為F-1、F-2、F-3、F-4、F-5、F-6、F-7。

圖2 PjFPS轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞系的nptⅡ基因的PCR檢測 M. DL2000 Marker；1～9.轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞系Fig.2 The PCR detection of nptⅡ gene in PjFPS-transgenic P.japonicus cell lines M. DL2000 Marker; 1-9. The transgenic P.japonicus cell lines

圖3 PjFPS基因相對表達(dá)量 WT.野生型珠子參細(xì)胞系；F-1～F-7. PjFPS轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞系 下同。Fig.3 The relative expression of PjFPS WT. The wild-type P.japonicus cell lines; F-1-F-7. The transgenic P.japonicus cells of PjFPS The same as below.

圖4 珠子參皂苷生物合成中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況 WT.野生型珠子參細(xì)胞系；FPS.法呢基焦磷酸合成酶基因的相對表達(dá)量；SS.鯊烯合成酶基因的相對表達(dá)量；DS.達(dá)瑪烯二醇合成酶基因的相對表達(dá)量；SE.鯊烯環(huán)氧酶基因的相對表達(dá)量；AS.香樹脂合成酶基因的相對表達(dá)量；HMGR. 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的相對表達(dá)量；CAS.環(huán)阿屯醇合成酶基因的相對表達(dá)量Fig.4 The relative expressions of key enzyme genes of P.japonicus saponins biosynthesis WT. The wild-type P.japonicus cell line; FPS. The relative expressions of farnesyl-pyrophosphate synthase gene; SS. The relative expressions of squalene synthase gene; DS. The relative expressions of dammarenediol-Ⅱ synthase gene; SE. The relative expressions of squalene epoxidase gene; AS. The relative expressions of amysyrin synthase gene; HMGR. The relative expressions of 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase gene; CAS. The relative expressions of cycloartenol synthase gene

圖5 PjFPS酶活Fig.5 The enzyme activities of PjFPS

2.2 與珠子參皂苷合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量及FPS酶活分析

以上述F-1～F-7株系的cDNA為模板進(jìn)行PjFPS基因相對表達(dá)量的分析。結(jié)果顯示這7株陽性細(xì)胞系中，PjFPS基因的相對表達(dá)量與野生型相比均有不同程度提高。F-3株系和F-5株系PjFPS基因相對表達(dá)量的增加最多，約為野生型對照組的12倍，而F-7株系為對照組的4倍(圖3)。PjFPS轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中(F-2株系)，PjFPS基因過表達(dá)引起了皂苷合成主代謝流以及下游分支代謝流相關(guān)其它重要基因的表達(dá)量出現(xiàn)不同程度提高(圖4)。酶活分析表明，F(xiàn)-1～F-7轉(zhuǎn)基因珠子參陽性細(xì)胞系FPS的活性與野生型相比均有提高。其中F-5株系的PjFPS酶活最高，約為野生型株系的4倍(圖5)。各陽性細(xì)胞系PjFPS基因表達(dá)量的變化趨勢基本與酶活變化有較好的對應(yīng)關(guān)系。

2.3 皂苷含量及植物甾醇含量的測定與分析

F-1～F-7中珠子參總皂苷含量與未轉(zhuǎn)基因的珠子參細(xì)胞系相比有明顯的提高。在整個實(shí)驗(yàn)組中，F(xiàn)-5株系總皂苷含量約為野生型對照組的3倍，也明顯高于其它陽性細(xì)胞系(圖6)。7株轉(zhuǎn)基因珠子參陽性細(xì)胞系中植物甾醇含量與野生型相比均有不同程度的增加(圖7)。因此過表達(dá)PjFPS不僅可以有效提高珠子參中主要活性成分皂苷的含量也可以提高植物甾醇的含量。

圖6 總皂苷含量Fig.6 The contents of the total saponins

圖7 總甾醇含量Fig.7 The contents of phytosterol

3 討論

人參屬藥材中，人參、三七備受關(guān)注，研究較多，珠子參雖為中國傳統(tǒng)名貴中藥，卻長期缺乏系統(tǒng)認(rèn)識和研究。近年來，越來越多的研究證明珠子參具有廣泛而重要的藥理學(xué)活性，因此，相關(guān)基礎(chǔ)研究有必要受到重視和加強(qiáng)。其中，研究珠子參主要活動成分三萜皂苷的生物合成途徑，了解影響珠子參皂苷合成的關(guān)鍵酶，顯得尤為重要。我們課題組曾經(jīng)開展過三七皂苷生物合成的研究，積累了一些經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為從分子水平上影響人參屬三萜皂苷合成的關(guān)鍵因素主要包括：(1)合成途徑中重要酶催化步驟功能基因的表達(dá)；(2)控制多個關(guān)鍵酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子活性。

目前，珠子參皂苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆研究已取得了一些進(jìn)展。Huang等首次從珠子參中克隆獲得珠子參皂苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因PjAS，該基因是控制皂苷合成流向齊墩果烷型皂苷的第一個關(guān)鍵酶基因[19]。此外，珠子參皂苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因PjDS和PjSS也相繼被克隆[20]。FPS是植物三萜皂苷合成途徑中偏上游的關(guān)鍵酶，關(guān)于珠子參FPS的研究鮮有報道，已有的相關(guān)研究主要集中五加科的其他物種，包括從人參(Panaxginseng)中克隆了編碼343個氨基酸且長度為1 134 bp的FPS基因[21]；從常春藤(Hederahelix)中克隆了編碼342個氨基酸且長度為1 050 bp的常春藤FPS基因[22]；從三七(Panaxnotoginseng)中克隆了編碼343個氨基酸且長度為1 031 bp的FPS基因(DQ059550)[23]。本研究成功克隆了編碼342個氨基酸且長度約為1 200 bp的珠子參皂苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因PjFPS的cDNA序列，通過比對發(fā)現(xiàn)珠子參FPS基因(KP684141)與上述幾種植物的FPS基因均具有98%以上的相似性。

調(diào)控珠子參皂苷合成的策略可從兩個層面展開。一是細(xì)胞水平上的調(diào)控，即對珠子參植株進(jìn)行物理、化學(xué)或環(huán)境脅迫，誘導(dǎo)皂苷合成量的增加，該方法難以實(shí)現(xiàn)對皂苷合成的穩(wěn)定調(diào)控，操作層面粗放，效果一般，是根據(jù)次生代謝物合成的特點(diǎn)引起“量”的變化，而不能改變遺傳上的本質(zhì)因素[24]；二是從分子水平影響皂苷合成，通過直接控制皂苷合成的關(guān)鍵酶基因或者相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，形成定向、高效、可靠的皂苷合成調(diào)控手段，分子操作是控制皂苷合成的根本途徑。本研究通過過表達(dá)珠子參FPS基因的的方法，成功促進(jìn)了珠子參皂苷的生物合成，提高了皂苷含量，明確了珠子參中FPS的功能。通常認(rèn)為，F(xiàn)PS可能是植物三萜合成的重要調(diào)控點(diǎn)[25]，國內(nèi)外對于FPS基因的功能研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。Kim等通過構(gòu)建人參PgFPS基因過表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到人參發(fā)根中，實(shí)現(xiàn)PgFPS基因在人參發(fā)根細(xì)胞中過表達(dá)，從而引起了人參皂苷含量的增加，其中該轉(zhuǎn)基因人參發(fā)根中PgFPS基因相對表達(dá)量和皂苷含量與野生型相比分別提高了十倍和三倍以上[26]。另外，將人參FPS在積雪草中過量表達(dá)，可提高積雪草中的固醇類和三萜類化合物的積累。在煙草FPS功能研究方面，F(xiàn)PS基因過量表達(dá)可以促進(jìn)煙草葉片中類胡蘿素生物合成[27]；將薄荷FPS在煙草中過表達(dá)，同樣可提高煙草及煙草發(fā)根中倍半萜植保素的積累量[28]；我們的前期研究表明，在三七細(xì)胞中同時過表達(dá)PnHMGR與PnSS，三七皂苷的生物合成能力可提高約四倍，而且同時過表達(dá)兩個關(guān)鍵酶基因?qū)υ碥蘸铣傻挠绊懘_實(shí)比僅過表達(dá)一個基因要明顯[29]。本研究中還發(fā)現(xiàn)，由于皂苷代謝流的增加，直接促進(jìn)了與皂苷合成相關(guān)的重要酶基因的表達(dá)。同時，除了皂苷合成被促進(jìn)外，植物甾醇的合成也增加了，其原因在于PjFPS是三萜合成途徑中比較上游的關(guān)鍵酶，植物甾醇與三萜皂苷的合成共享路徑(圖1)，因此，PjFPS的表達(dá)增加，提高了整條通路的代謝流，于是三萜皂苷合成支路代謝流增加的同時，植物甾醇合成支流的流量也隨之增加，最終導(dǎo)致珠子參皂苷和植物甾醇的合成同時獲得了促進(jìn)。

本研究在珠子參細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了PjFPS的過表達(dá)，成功促進(jìn)了珠子參皂苷的合成，證明PjFPS確實(shí)是珠子參皂苷合成的關(guān)鍵酶，能夠有效影響三萜皂苷以及植物甾醇的合成。接下來，將重點(diǎn)研究關(guān)鍵酶基因與重要轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，力圖把關(guān)鍵酶調(diào)控層面與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控層面結(jié)合起來，構(gòu)建更為高效、科學(xué)、合理的皂苷調(diào)控手段，全方位、多角度解析珠子參皂苷的合成機(jī)制。