王立敏，陳 思，丁 儉，齊寶坤，王中江，江連洲，隋曉楠，Olga Olegovna BABICH，李 楊*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

生物解離作為一種新興的經(jīng)濟(jì)、安全、綠色提油技術(shù)，以機(jī)械破碎和酶解為手段，提取條件溫和，且提取的油脂品質(zhì)較高、色澤較好[1]。但是，提油過程中由于雙親性磷脂、蛋白質(zhì)對(duì)油脂的親和力，導(dǎo)致大部分油脂被包裹在乳狀液中，限制了油脂提取率，很大程度降低了該技術(shù)的經(jīng)濟(jì)效益[2]。因此，探究乳狀液的穩(wěn)定特性，從而選擇合適的破除技術(shù)是提高油脂提取率的重要途徑之一。其中具有特殊功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)是乳狀液失穩(wěn)的關(guān)鍵因素[3]。

近年來，較多關(guān)于酶解對(duì)乳液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性能的研究。這些研究通常利用不同水解度（degree of hydrolysis，DH）的蛋白質(zhì)制備乳液，分析酶解后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征變化。Avramenko等[4]研究表明酶解可以改變蛋白質(zhì)的疏水位點(diǎn)，從而使表面疏水性及乳化特性發(fā)生變化；Zheng Lin等[5]研究表明酶解過程也可以改變蛋白亞基、構(gòu)象及疏水性氨基酸組成，從而改變?nèi)橐旱姆€(wěn)定性。也有利用相反的方法來研究酶解對(duì)乳液中蛋白結(jié)構(gòu)影響，即利用不同DH的天然乳液，從乳液中分離具有不同DH的肽，并分析不同酶解程度的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，Zhang Shaobing等[6]比較了水酶法花生乳狀液中蛋白與未酶解的花生蛋白表面特性（表面疏水性、二硫鍵、乳化特性、表面張力），發(fā)現(xiàn)經(jīng)過酶解后乳狀液中蛋白質(zhì)的二硫鍵、表面疏水性、乳化特性均下降，且發(fā)現(xiàn)由酶解引起的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、二硫鍵含量及表面疏水性的急劇下降有助于乳液的失穩(wěn)。但是目前缺乏關(guān)于生物解離大豆乳狀液蛋白質(zhì)的研究，且具有特殊功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)是穩(wěn)定乳狀液的關(guān)鍵因素，分析乳狀液蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及表面特性是實(shí)現(xiàn)乳狀液失穩(wěn)的有效途徑。

Morales等[7]研究指出隨著酶解程度加深，生物解離大豆乳狀液越來越不穩(wěn)定。因此為了探究蛋白質(zhì)/多肽穩(wěn)定乳狀液機(jī)制，采用酶解時(shí)間（1、2、3 h）、酶添加量（1%、2%）作為研究條件，通過掃描電子顯微鏡觀察、乳化特性、表面疏水性、氨基酸分析及傅里葉變換紅外光譜對(duì)不同酶解程度下的乳狀液蛋白質(zhì)/多肽表面性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期為大豆生物解離過程中避免或減少乳狀液形成、尋求適當(dāng)?shù)钠迫榉椒ㄌ峁┮罁?jù)與應(yīng)用指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擠壓膨化大豆粉（擠壓膨化后的豆粕經(jīng)研磨過60 目篩；成分：蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)17%，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%） 山東高唐藍(lán)山股份有限公司；堿性蛋白酶Protex 6L（8 900 U/mL） 諾維信生物技術(shù)有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、丙酮等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；水浴鍋英國(guó)IKA公司；PHS-25數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)SIM公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、S-3400掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)尼高麗公司。

1.3 方法

1.3.1 生物解離大豆乳狀液蛋白質(zhì)的制備

根據(jù)江連洲等[8]的方法制備生物解離大豆乳狀液，首先稱取一定量的擠壓膨化大豆粉，按照質(zhì)量比1∶6加入蒸餾水，再加入精準(zhǔn)量取的Protex 6L堿性蛋白酶添加量1%、2%，用玻璃棒快速攪拌均勻并放入55 ℃水浴鍋中進(jìn)行恒溫酶解，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)勻漿pH值為9.0，分別酶解1、2、3 h后，再利用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7，然后100 ℃加熱5 min進(jìn)行滅酶處理。滅酶后于4 ℃、9 000×g離心20 min，離心后吸取游離油，倒出水解液后得到乳狀液。乳狀液水相中蛋白質(zhì)提取方法采用丙酮沉淀法[9]，將冰丙酮與乳狀液按照體積比20∶1于-18 ℃反應(yīng)2 h，然后于4 ℃、12 000×g離心15 min，除去上清液后的沉淀利用冰丙酮洗滌5～6 次，直到溶劑由黃色變成無色，最后蛋白質(zhì)經(jīng)凍干成粉末。

1.3.2 掃描電子顯微鏡觀察

將凍干后的乳狀液蛋白樣品固定在樣品臺(tái)上鍍金，鍍金方法：離子濺射；鍍金條件：15 kV、15 mA、2.5 min。最后將樣品置于掃描電子顯微鏡（15 kV）下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.3 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照Z(yǔ)hang Shaobing等[6]的方法測(cè)定乳狀液蛋白質(zhì)的乳化活性指數(shù)（emulsion activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）：取30 mL不同酶解條件下乳狀液蛋白質(zhì)溶液，分別加入10 mL大豆油均質(zhì)使其混合均勻，取50 μL上述乳液加入5 mL 0.1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉溶液，渦旋振蕩混勻后在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A0。靜置30 min后再次測(cè)定吸光度A30。EAI和ESI按公式（1）、（2）計(jì)算：

式中：N為稀釋倍數(shù)（250）；C為乳液在形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度/（g/mL）；Φ為乳狀液中油相體積分?jǐn)?shù)/%；A0、A30分別為0、30 min時(shí)的吸光度。

1.3.4 表面疏水性的測(cè)定

依據(jù)Kato等[11]的方法，即ANS熒光探針法。稱取0.025 g不同酶解條件下的蛋白質(zhì)樣品溶于50 mL 0.01 mol/L pH值為7的磷酸鹽緩沖液中，25 ℃攪拌1 h，然后以10 000×g離心30 min，利用Lowry法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)濃度，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液依次將樣品稀釋，得到濃度為0.005～0.5 mol/mL蛋白質(zhì)溶液，取溶液4 mL，分別加入40 μL 8 mmol/L的ANS溶液，快速振蕩?kù)o置5 min后，測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)468 nm，夾縫5 nm，掃描速率10 nm/s。以熒光強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度作圖，表面疏水性指數(shù)（S0）為蛋白質(zhì)分子的初始段斜率。

1.3.5 氨基酸組成測(cè)定

利用氨基酸全自動(dòng)分析儀酸水解法分別測(cè)定不同樣品氨基酸組成，取一定的樣品加入6 mol/L鹽酸溶液封管，然后在110 ℃烘箱中水解22 h，水解后用0.45 μm濾膜進(jìn)行過濾，將濾液倒入50 mL容量瓶中，并用水定容。取1 mL濃縮，復(fù)溶，重復(fù)2～3 次后過濾進(jìn)樣，進(jìn)樣量50 μL。測(cè)定乳狀液蛋白質(zhì)中17 種氨基酸含量[12]。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜的測(cè)定

紅外光譜測(cè)定采用KBr壓片法，稱取真空凍干蛋白樣品1 mg，加入溴化鉀100 mg，然后在瑪瑙研缽中研磨約15 min，隨后進(jìn)行壓片處理，壓片機(jī)在14 kg壓力下約保持1 min壓片后進(jìn)行測(cè)定。在室溫條件下，設(shè)定掃描波數(shù)譜段范圍4 000～400 cm-1，分辨率設(shè)定為4 cm-1，在波數(shù)精度0.01 cm-1條件下掃描64 次，不同處理的圖譜掃描重復(fù)3 次。利用Peakfit Version軟件分析譜圖，采用Gauss峰形進(jìn)行擬合后估算出子峰的位置和個(gè)數(shù)，根據(jù)各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用積分面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量[13]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，利用ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析，并用Origin 8.0和Excel統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并繪圖，P小于0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解條件下乳狀液蛋白質(zhì)微觀形態(tài)

圖1 不同酶解條件下乳狀液蛋白的掃描電子顯微鏡（×3 000）Fig. 1 Scanning electron microscope images of protein emulsions prepared under different enzymatic hydrolysis conditions ( × 3 000)

掃描電子顯微鏡可以直觀地觀察到酶解后乳狀液蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化（顆粒大小、形狀），分析油滴被蛋白包裹狀態(tài)，進(jìn)而分析乳液的穩(wěn)定性[14]。前人研究了乳狀液結(jié)構(gòu)，其球狀油滴由表面蛋白包裹而成[1]，且發(fā)現(xiàn)酶解剛開始油滴被蛋白包裹，油脂與蛋白兩相分明，且大小分布均勻；隨著酶解進(jìn)行，覆蓋在油滴表面的蛋白進(jìn)入游離油相中，油滴發(fā)生聚集。據(jù)前期研究可知[15]，隨著酶解程度加深，DH逐漸增大。由圖1可知，在相同條件下觀察不同酶解程度的乳狀液蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。酶解1 h時(shí)，乳狀液蛋白表現(xiàn)為致密有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)乳狀液結(jié)構(gòu)分析，油脂可以較好地填充在蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)空間內(nèi)，使乳狀液結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定、均一，這與前期的研究[15]一致。隨著酶解程度的增加，乳狀液表面蛋白從油滴表面脫落，其結(jié)構(gòu)由致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變成了無規(guī)則的絮狀如圖1C、D所示，從而導(dǎo)致油滴發(fā)生聚集，乳狀液逐漸不穩(wěn)定[2]。酶解3 h時(shí)乳狀液蛋白質(zhì)的電子顯微鏡圖更是發(fā)生了明顯變化，結(jié)構(gòu)和質(zhì)地變得疏松，緊密性逐漸減弱，并出現(xiàn)微小孔洞如圖1E、F所示。這主要由于剛開始DH比較低，部分蛋白質(zhì)尚未水解掉，如圖1A、B中尚殘留有部分片狀蛋白質(zhì)；隨著酶解程度的增加，乳狀液中的蛋白分子骨架被打開，酶分子進(jìn)入蛋白分子內(nèi)部，加深了蛋白質(zhì)的酶解程度使其結(jié)構(gòu)及質(zhì)地變得疏松，緊密性越來越弱[16]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)越發(fā)失去了穩(wěn)定乳狀液的作用。

2.2 不同酶解條件對(duì)乳狀液蛋白質(zhì)EAI和ESI的影響

圖2 不同酶解條件對(duì)乳狀液蛋白質(zhì)EAI及ESI的影響Fig. 2 Effect of different hydrolysis conditions on emulsion activity index and stability index of protein emulsions

EAI表示的是乳狀液中蛋白質(zhì)/肽能夠強(qiáng)烈吸附在油-水界面形成乳化層的能力；ESI代表乳狀液中乳滴的穩(wěn)定能力。EAI和ESI為乳狀液中蛋白質(zhì)/肽乳化特性及穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一[17]。Zhao Qiang[18]及Lam[19]等研究發(fā)現(xiàn)酶解不利于蛋白質(zhì)的乳化特性，蛋白質(zhì)的乳化特性和肽的尺寸之間存在明確聯(lián)系，即酶解產(chǎn)生的小分子質(zhì)量肽會(huì)使蛋白質(zhì)溶解性增加，降低蛋白質(zhì)的乳化特性；同時(shí)，小分子質(zhì)量肽會(huì)降低界面張力不足以穩(wěn)定乳液，也會(huì)削弱其乳化特性。經(jīng)由不同酶解時(shí)間（1、2、3 h）及不同酶添加量（1%、2%）后，從圖2可以看出，隨著酶解的進(jìn)行，EAI和ESI總體也都呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢(shì)，且變化較明顯，由酶解條件1%、1 h（EAI為200 m2/g，ESI為80 min）變化到2%、3 h（EAI 為110 m2/g，ESI為30 min），這主要由于隨著酶解過程的進(jìn)行，吸附在油滴表面的蛋白被酶解成小分子質(zhì)量的肽，導(dǎo)致其從油滴表面脫落，再重新與油滴吸附時(shí)，不能迅速吸附在油滴表面，界面膜遭受破壞，無法保持完整性，其EAI和ESI大幅度降低[20]。另外，蛋白酶的過度酶解也會(huì)使維持界面蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)力（包括氫鍵、范德華力、離子鍵等）逐漸被破壞，使包裹油滴的保護(hù)膜越來越薄，導(dǎo)致EAI和ESI的降低[21]，這也是乳狀液失穩(wěn)的重要原因之一。

2.3 表面疏水性結(jié)果

圖3 不同酶解條件對(duì)乳狀液蛋白質(zhì)表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of different hydrolysis conditions on surface hydrophobicity of protein emulsions

S0是用來表征蛋白表面疏水基團(tuán)數(shù)量的一個(gè)重要指數(shù)，也是反映蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化的重要指標(biāo)之一[22]。Zhang Shaobing[6]與Betancur[23]等發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)發(fā)生酶解時(shí)會(huì)暴露出大量的疏水性殘基，同時(shí)在酶解反應(yīng)過程中，暴露出的疏水性殘基會(huì)發(fā)生交聯(lián)聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性下降。圖3為不同酶解條件下的乳狀液蛋白質(zhì)表面疏水性，酶添加量1%、酶解時(shí)間1 h時(shí)，S0最大（260），隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)及酶添加量的增加，S0逐漸減小，酶添加量2%、酶解時(shí)間3 h時(shí)，S0達(dá)到最小值（90），這與Betancur等[23]結(jié)果一致。推測(cè)是由于酶解過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生變性而暴露出內(nèi)部的疏水殘基，亞基之間通過疏水相互作用而發(fā)生聚集，形成可溶性或不可溶性的聚集體，這些聚集體會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域產(chǎn)生屏蔽作用，阻礙了疏水基團(tuán)與熒光探針ANS的有效結(jié)合，導(dǎo)致乳狀液蛋白質(zhì)表面疏水性降低[24]，蛋白疏水性降低使其不容易吸附于油滴表面，從而使乳狀液失穩(wěn)。

2.4 乳狀液中蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析

表 1 不同酶解條件下乳狀液中蛋白質(zhì)/多肽的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition of protein emulsions obtained under different enzymatic hydrolysis conditions

表面疏水性和疏水性氨基酸是2 個(gè)相關(guān)性指標(biāo)。從表1可以看出，隨著酶解程度的進(jìn)行，乳狀液蛋白質(zhì)中Ile、Try、Phe、Leu、Val、Ala等比例增加，其中Ile、Leu、Phe、Val均為疏水氨基酸，這與Zheng Lin等[5]的研究一致。這是由于在酶解過程中，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，使一些脂肪族和芳香族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)從蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露出來，酶解程度越深，這些芳香族氨基酸暴露的越多，而一些帶有苯環(huán)的芳香族氨基酸大多是疏水性氨基酸（如Phe、Try、Trp），因此酶解導(dǎo)致疏水性氨基酸比例增加[25]。另外，F(xiàn)ischer等[26]研究表明酶解后由高比例的疏水性氨基酸引起的疏水性相互作用對(duì)肽聚集有很大貢獻(xiàn)，酶解使蛋白質(zhì)的肽鏈越來越短，其受到的空間阻礙越來越弱，這時(shí)肽鏈更容易通過疏水相互作用發(fā)生聚集，從而減少了與熒光探針相結(jié)合的疏水基團(tuán)數(shù)量，S0呈下降趨勢(shì)，且酶解程度越深，其疏水性指數(shù)降低的越明顯，表面疏水性降低使其不容易吸附于油滴表面，導(dǎo)致乳狀液失穩(wěn)，這與上述S0結(jié)論一致。

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜圖可提供蛋白質(zhì)酰胺I帶、酰胺II帶、酰胺III帶信息以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的C—C振動(dòng)和C=O等振動(dòng)信息[27]。另外，傅里葉變換紅外光譜中蛋白質(zhì)酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）頻率的遷移與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。根據(jù)已有研究，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與各子峰間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：α-螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)波數(shù)為1 646～1 664 cm-1；β-折疊結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)波數(shù)為1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)波數(shù)為1 664～1 681 cm-1；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)波數(shù)為1 637～1 645 cm-1[28]。采用Peakfit軟件對(duì)蛋白質(zhì)紅外光譜酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)紅外去卷積光譜擬合，通過峰位歸屬確定二級(jí)結(jié)構(gòu)種類和相對(duì)含量，計(jì)算結(jié)果見表2。

圖4 不同酶解條件下乳狀液中蛋白質(zhì)紅外光譜分析Fig. 4 FTIR spectra of protein emulsions prepared under different enzymatic hydrolysis conditions

圖5 不同酶解條件下乳狀液中蛋白質(zhì)酰胺I帶的擬合圖譜Fig. 5 Second-derivative FTIR spectra in the amide I region and Gaussian curve fitting for protein emulsions prepared under different enzymatic hydrolysis conditions

表2 不同酶解條件下乳狀液中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 2 Contents of the secondary structures of protein emulsions obtained under different enzymatic hydrolysis conditions%

由圖4可以看出，隨著酶解程度的加深，峰的強(qiáng)度及峰面積發(fā)生了變化。3 200～3 700 cm-1之間的吸收峰變強(qiáng)、面積增大，這主要由于酶解過程中肽鍵斷裂引入H2O分子，導(dǎo)致—OH的伸縮振動(dòng)和—NH的振動(dòng)[29]。另外，由圖5得出，酶解過程中只是峰的強(qiáng)度及峰面積發(fā)生了改變，乳狀液蛋白質(zhì)分子上的化學(xué)基團(tuán)沒有發(fā)生本質(zhì)的變化，說明酶解改變了乳狀液蛋白質(zhì)構(gòu)象所占的比例，導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化（表2）。隨著酶解程度的加深，α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲與其他幾種構(gòu)象相比顯然是一種更加松散的結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲增加，說明蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液的能力降低。推測(cè)是由于酶解過程使得維持界面蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)力（包括氫鍵、范德華力、離子鍵等）逐漸被破壞，改變了乳狀液蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，乳狀液逐漸失去穩(wěn)定性[30]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選用不同酶解時(shí)間（1、2、3 h）、酶添加量（1%、2%）條件下得到的生物解離大豆乳狀液蛋白質(zhì)，分析了不同酶解條件對(duì)乳狀液蛋白質(zhì)/多肽表面性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征的影響。

通過掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示：酶解剛開始由于DH較低，乳狀液蛋白表現(xiàn)為致密有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，酶解時(shí)間3 h時(shí)乳狀液蛋白發(fā)生了明顯變化，結(jié)構(gòu)和質(zhì)地開始疏松，并伴隨微小孔洞出現(xiàn)。根據(jù)乳狀液的結(jié)構(gòu)分析，剛開始酶解時(shí)，油脂可以較好地填充在蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)空間內(nèi)，使乳狀液結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定、均一；酶解時(shí)間3 h時(shí)的蛋白質(zhì)越發(fā)失去了穩(wěn)定乳狀液的作用。

EAI和ESI分析表明，隨著酶解的進(jìn)行，EAI和ESI皆呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。主要由于隨著酶解過程進(jìn)行，吸附在油滴表面的蛋白被酶解成小分子質(zhì)量的肽，導(dǎo)致其從油滴表面脫落，再重新與油滴吸附時(shí)，不能迅速吸附在油滴表面，這也是乳狀液失穩(wěn)的重要原因之一。

氨基酸組成及表面疏水性分析發(fā)現(xiàn)，隨著酶解的進(jìn)行，表面疏水性下降。由于酶解后的疏水性殘基之間通過疏水相互作用發(fā)生聚集，形成可溶性或不可溶性的聚集體，對(duì)蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域產(chǎn)生屏蔽作用，導(dǎo)致表面疏水性下降；同時(shí)高比例疏水氨基酸引起的肽聚集，減少了與熒光探針相結(jié)合的疏水基團(tuán)數(shù)量，導(dǎo)致表面疏水性降低。表面疏水性降低使其不容易吸附于油滴表面，使乳狀液失穩(wěn)。

通過擬合紅外光譜酰胺I帶發(fā)現(xiàn)，隨著酶解程度的增加，α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，趨于更加松散的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液的能力降低。

生物解離乳狀液為半固體狀，屬于食品膠體，因此通過上述指標(biāo)研究乳狀液中蛋白質(zhì)/肽穩(wěn)定乳狀液機(jī)制，發(fā)現(xiàn)酶解過程中乳狀液蛋白EAI和ESI降低，部分蛋白質(zhì)疏水性氨基酸殘基比例增大，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為無規(guī)則卷曲。這是酶解過程中乳狀液失穩(wěn)主要原因之一。該結(jié)論為生物解離乳狀液破乳機(jī)制提供理論支持。