江 虹，王 芳，吳征真，曾慶瑞

（長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 408100）

Cu是人體必需的微量元素之一，對維持機(jī)體的正常代謝具有重要作用，它參與多種酶的構(gòu)成，參與造血及形成色素，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌、生殖及免疫機(jī)能。若人體內(nèi)缺Cu，會(huì)發(fā)生貧血、腹瀉、頭暈、眼花、耳鳴、乏力、生長停滯、骨質(zhì)疏松、冠心病和糖尿病等疾??；若人體Cu過量，則會(huì)引起惡心、嘔吐、上腹疼痛等中毒現(xiàn)象[1]。人體中的Cu主要從日常飲食中攝入，而日常食品如餅干、面條、奶粉等通常由于加工中使用Cu器設(shè)備而受到污染，因此研究食品中Cu具有重要意義。

目前測定Cu的方法主要有：原子吸收法[2-6]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[7-10]、電化學(xué)法[11-21]、分光光度法[22-27]、熒光法[28-30]等。原子吸收法因分析成本高，所用儀器價(jià)格較貴而不易普及。電感耦合等離子體質(zhì)譜法有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但分析成本高、儀器貴，仍不易普及。其他方法或靈敏度較低或?qū)嶒?yàn)條件要求較苛刻或分析成本較高。瑞利光散射（Rayleigh light scattering，RLS）技術(shù)是近年新發(fā)展起來的一種高靈敏分析技術(shù)，在食品分析方面應(yīng)用較少，尤其是用雙波長瑞利光散射（dual-wavelength Rayleigh light scattering，DWO-RLS）法測定食品中Cu的含量，目前尚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以溴甲酚綠（bromocresol green，BRG）作探針，在酸性溶液和陽離子表面活性劑——溴代十六烷基吡啶（hexadecylpyridinium bromide，TPB）存在下，用DWORLS技術(shù)測定Cu的含量，得到較滿意的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該體系的譜線上有兩個(gè)較大的散射峰，在最大和次大散射波長處Cu（II）的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與體系的RLS猝滅程度（ΔIRLS）有線性關(guān)系，該方法簡便、快速、靈敏，適于食品中Cu的快速測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈣奶餅干（1#）、兒童營養(yǎng)餅干（2#）、餅干（3#、4#）、面條（5#、6#）、幼兒配方奶粉（7#、8#）、嬰兒配方奶粉（9#、10#） 市售；TPB 上海乙基化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 齊一生物科技（上海）有限公司；BRG 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Cu(NO3)2·3H2O（99.9%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-2500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；pHS-3C精密酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

C u（I I）標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取一定量的Cu(NO3)2·3H2O于小燒杯中，用水溶解，配成6.355 mg/L貯備液，工作液為0.6355 mg/L。BRG溶液：稱取適量溴甲酚綠于小燒杯中，加少量無水乙醇使其溶解，再轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用水定容，配成1.0×10-3mol/L的溶液，工作液為1.0×10-4mol/L。TPB溶液：稱取適量的TPB，加少量無水乙醇溶解，用水稀釋配成4.00×102mg/L。Tris-鹽酸溶液：將適量的0.10 mol/L鹽酸溶液與適量的0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度計(jì)測定，配成pH 3.0～8.5的Tris-鹽酸溶液。

1.3.2 樣品處理

在電子天平上用固定質(zhì)量稱量法準(zhǔn)確稱取1.1節(jié)中已搗碎、混勻、并按四分法縮分的1#樣品5.000 0 g，2#～10#樣品各10.000 0 g（允許誤差±0.0001 g）于各瓷坩堝中，置于可調(diào)電爐上，在低溫下加熱至樣品完全炭化后，再將溫度調(diào)至500～550 ℃，灼燒灰化約5 h，冷卻后，取出坩堝，用體積比為1∶1 HNO3溶液（取50 mL濃HNO3置于適量水中，再用水稀釋至100 mL）2.0 mL潤濕灰分，再在電爐上低溫加熱蒸干，然后在500～550 ℃條件下灼燒約2 h，冷卻后，取出坩堝，加入1∶1 HNO3溶液2.0 mL，水8 mL，攪拌，低溫加熱使灰分完全溶解，待冷卻后，過濾，濾液置于100 mL容量瓶中，再加1∶2三乙醇胺溶液（三乙醇胺和水的體積比為1∶2）（掩蔽Fe3+、Al3+）3.0 mL，用水稀至刻度，即為待測液。

1.3.3 RLS強(qiáng)度的測定

在具塞比色管中，依次準(zhǔn)確加入1.0 0 m L pH 4.81 Tris-鹽酸溶液，3.00 mL 1.0×10-4mol/L BRG溶液，0.20 mL 4.00×102mg/L TPB溶液及適量的0.6355 mg/L Cu（II）標(biāo)準(zhǔn)溶液（或樣液），用超純水稀釋至10.0 mL刻度，搖勻，35 min后，將溶液于熒光光度計(jì)上（λex=λem=220 nm）進(jìn)行同步掃描（測定狹縫5 nm），得光譜，記錄最大波長528 nm和次大波長361 nm處體系和試劑空白的RLS強(qiáng)度IRLS（528 nm）、IRLS（361 nm）及I0（528 nm）、I0（361 nm），按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu（II）-TPB-BRG的RLS光譜

圖1 BRG-Cu（II）-TPB的RLS光譜Fig.1 RLS spectra of bromocresol green-Cu(II)-cetylpyridine bromide

從圖1可知，Cu（II）、BRG及TPB溶液在實(shí)驗(yàn)測定條件下，其自身的RLS光譜十分微弱（曲線1～3），BRG在Tris-鹽酸的酸性溶液中的RLS也很微弱（曲線4），TPB在Tris-鹽酸的酸性溶液中較微弱（曲線5）。當(dāng)BRG與TPB在酸性Tris-鹽酸溶液中混合后RLS信號顯著增強(qiáng)（曲線6），光譜曲線上出現(xiàn)3 個(gè)明顯的RLS峰，最大峰位于528 nm，次大峰位于361 nm，相對最小的散射峰位于306 nm；RLS增強(qiáng)的原因主要：BRG是一種酸性染料，其分子結(jié)構(gòu)上有2 個(gè)可離解的酚基氫，在溶液中離解后帶負(fù)電荷，而TPB是一種陽離子表面活性劑，其分子結(jié)構(gòu)上有1個(gè)可離解的Br-，在溶液中離解后帶正電荷，在實(shí)驗(yàn)條件下，帶正電荷的陽離子表面活性劑TPB以預(yù)膠束聚集體存在，而帶負(fù)電荷的BRG則在其表面聚集，從而導(dǎo)致RLS光譜急劇增加，這也表明TPB可增敏BRG，生成離子締合物，使RLS增強(qiáng)。當(dāng)在BRGTPB的酸性Tris-鹽酸溶液中加入不同濃度的Cu（II）標(biāo)準(zhǔn)溶液后，在最大、次大和最小散射波長處，隨著Cu（II）濃度的不斷增大，BRG-TPB-Cu（II）體系的RLS強(qiáng)度不斷降低，即Cu（II）的加入使體系的RLS發(fā)生猝滅作用（曲線6～12）。猝滅原因：Cu（II）的加入，破壞了BRG-TPB締合物原有的平衡，部分BRG轉(zhuǎn)而與Cu（II）結(jié)合，從而導(dǎo)致BRG與TPB的分離，結(jié)果使RLS降低。實(shí)驗(yàn)表明，在361 nm和528 nm處，無論是用單波長法測定還是用DWO-RLS測定，Cu（II）在一定濃度范圍內(nèi)其質(zhì)量濃度與BRG-TPB-Cu（II）體系的猝滅程度ΔIRLS呈線性關(guān)系（曲線6～12），但用DWO-RLS測定時(shí)，其靈敏度約為單波長法的2 倍，故選擇用DWO-RLS法定量測定Cu（II）。

2.2 反應(yīng)條件的選擇

2.2.1 介質(zhì)酸度的影響

室溫條件下，考察在不同pH值的Tris-鹽酸介質(zhì)存在下，對BRG-TPB-Cu（II）體系ΔIRRS的影響。結(jié)果表明：BRG-TPB的RLS受酸度的影響較小，但加入Cu（II）后，BRG-TPB-Cu（II）體系的RLS受酸度的影響則較大。圖2為加入Cu（II）后，在528、361 nm 及（528+361）nm 波長處，BRG-TPB- Cu（II）體系的RLS增強(qiáng)強(qiáng)度（或猝滅程度）的絕對值│ΔIRLS│隨溶液pH值的變化情況。圖2不僅表明適宜酸度范圍為pH 4.2～5.3（在該范圍內(nèi)，體系的猝滅程度較大，即│ΔIRLS│較大，靈敏度較高），還表明用DWO-RLS法測定的靈敏度比單波長法更高。故實(shí)驗(yàn)用DWO-RLS法進(jìn)行測定，使用pH 4.81的Tris-鹽酸溶液作反應(yīng)介質(zhì)，適宜用量為1.00 mL。

圖2 pH值的影響Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLS

2.2.2 BRG溶液濃度的影響

圖3 BRG濃度的影響Fig.3 Effect of bromocresol green concentration on ΔIRLS

從圖3可知，當(dāng)BRG溶液的濃度增加到3.00×10-5mol/L時(shí)，Cu（II）的加入使體系的猝滅作用達(dá)到最大，即│ΔIRLS│最大，靈敏度相對最高。同時(shí)圖3也表明，用DWO-RLS法測定，其靈敏度比單波長法高。故實(shí)驗(yàn)采用DWO-RLS法進(jìn)行測定，選用1.00×10-4mol/L BRG溶液的濃度為3.00 mL。

2.2.3 表面活性劑的影響

室溫條件下，考察TPB、溴化十六烷基三甲基銨、十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、Tween-20、Triton X-100等對BRG-TPB-Cu（II）體系ΔIRLS的影響。結(jié)果表明，只有TPB和溴化十六烷基三甲基銨對體系有增敏性，尤以TPB效果最好。繼而研究了不同濃度的TPB溶液對BRG-TPB- Cu（II）體系ΔIRLS的影響，結(jié)果表明：當(dāng)TPB濃度為8.00 mg/L時(shí)，Cu（II）的加入使體系的猝滅作用達(dá)最大，即│ΔIRLS│最大，靈敏度相對最高。同理，用DWO-RLS法測定的靈敏度比單波長法高，故實(shí)驗(yàn)用DWORLS法進(jìn)行測定，使用4.00×102mg/L TPB溶液0.20 mL。

2.2.4 試劑加入順序的影響

室溫條件下，考察在優(yōu)化的反應(yīng)條件下試劑在不同加入順序時(shí)對BRG-TPB- Cu（II）體系ΔIRLS的影響。結(jié)果表明，按1.3.3節(jié)DWO-RLS強(qiáng)度的測定中的試劑加入順序?yàn)樽罴选９蕦?shí)驗(yàn)按Tris-鹽酸溶液、BRG溶液、TPB溶液、Cu（II）標(biāo)準(zhǔn)溶液的順序加入各試劑。

2.2.5 體系的反應(yīng)速度及穩(wěn)定性

室溫條件下，考察BRG-TPB- Cu（II）體系在不同反應(yīng)時(shí)間對ΔIRLS的影響。結(jié)果表明，BRG與TPB的反應(yīng)很快就能完成，當(dāng)加入Cu（II）溶液后，隨著時(shí)間的延長，體系的RLS強(qiáng)度逐漸降低，35 min后RLS信號趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定時(shí)間至少可保持1.5 h。即BRG、TPB及Cu（II）之間在35 min內(nèi)可以反應(yīng)完全，故實(shí)驗(yàn)選在35 min后測定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)參數(shù)

在優(yōu)化條件下，按DWO-RLS強(qiáng)度的測定方法配制Cu（II）的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，并掃描RLS光譜。以ΔIRLS對相應(yīng)的Cu（II）的質(zhì)量濃度（ρ）作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的一元線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及方法的檢出限見表1。由表1可知，用DWO-RLS法測定的靈敏度比單波長法高。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table1 Calibration standard curves, LODs and LOQs

2.4 方法的選擇性

在0.063 6 mg/L Cu（II）存在下，用DWO-RLS法考察了某些常見陰、陽離子對Cu（II）測定的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，除Fe3+、Al3+的允許量相對較小，可能有一定的干擾外，其他陰、陽離子均不干擾測定。而Fe3+、Al3+的干擾可加入1∶2的三乙醇胺溶液1.0 mL予以掩蔽。故該方法具有好的選擇性。

表2 共存物質(zhì)的影響Table2 Effect of coexisting substances

2.5 樣品分析結(jié)果

表3 樣品分析結(jié)果及回收實(shí)驗(yàn)（n=5）Table3 Recoveries of Cu from spiked real samples (n= 5)

取1.3.2節(jié)中的待測樣液各2.00 mL，按DWO-RLS強(qiáng)度的測定方法加入各試劑溶液并掃描RLS光譜，各平行測定5份，根據(jù)測得的ΔIRLS，在DWO-RLS法的標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程上求得各待測樣液的濃度并推至原始樣品的含量。同時(shí)作加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，各平行測定5份，求出平均回收率。由表3可知，本法測定結(jié)果與GB/T 5009.13—2003《食品中銅的測定》中的火焰原子吸收法基本一致，回收率為98.6%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～2.5%，結(jié)果表明，方法有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié) 論

定量檢測Cu含量的DWO-RLS法與國標(biāo)法中的火焰原子吸收法相比，對儀器的要求和儀器的使用成本更低，操作更簡便、快速；而靈敏度方面，國標(biāo)法中的火焰原子吸收法的檢出限為1.0 mg/kg，本體系的單波長法在361 nm和528 nm處的檢出限分別為9.81 ng/mL和8.62 ng/mL，雙波長法的檢出限為4.61 ng/mL，由此可知，無論是單波長法還是雙波長法其靈敏度均比國標(biāo)法好，其中又以雙波長法更靈敏。除此之外，本法有較寬的線性范圍，準(zhǔn)確度、精密度及選擇性均能較好的滿足痕量分析要求。方法所用試劑價(jià)廉易得，樣品處理安全、可靠，適于多種食品中Cu的快速測定。