線婷，王荻，劉紅柏

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081)

施氏鱘AcipenserschrenckiBrandt隸屬于鱘形目、鱘科、鱘屬，是中國黑龍江流域的大型經(jīng)濟魚類，因其具有個體大、存活率高、肉質(zhì)鮮美等特點，開發(fā)應(yīng)用前景十分廣闊。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，水溫變化、水質(zhì)惡化、疾病暴發(fā)等因素均會直接影響?zhàn)B殖動物的正常生長與發(fā)育，進(jìn)而使養(yǎng)殖戶蒙受經(jīng)濟損失。魚類屬于冷血變溫動物,冷水性魚類對高水溫更加敏感[1]。高水溫會一定程度抑制魚類生長,并且損害魚體健康甚至造成死亡[2]。當(dāng)水域溫度超過魚類適宜生存的溫度時，魚體就會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[3]，15～27 ℃為施氏鱘的最適生長水溫[4]，高溫會使其非特異性免疫功能受到抑制[5]。研究表明，當(dāng)水溫超過28 ℃時，鱘魚的生理機能會受到嚴(yán)重?fù)p傷[6]。在養(yǎng)殖與運輸過程中，水溫改變會對施氏鱘免疫系統(tǒng)造成一定影響。因此，越來越多的技術(shù)人員致力于研發(fā)出能夠增強魚體自身機能、提高魚體抗應(yīng)激能力的免疫增強劑。

中草藥富含多種生物活性物質(zhì)，是一種綠色、安全的藥品，近年來被越來越多的應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[7]。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥具有調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物免疫功能[8]、提高水產(chǎn)動物攝食能力、增強水產(chǎn)動物抗應(yīng)激能力等功效[9-10]。開發(fā)綠色、天然的抗應(yīng)激中草藥免疫增強劑以有效提高水產(chǎn)動物的免疫力已逐漸成為一種趨勢。

中草藥免疫增強劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用正逐年增加。近年來，利用中草藥提高水產(chǎn)動物的免疫力，預(yù)防疾病暴發(fā)一直是眾多學(xué)者研究的熱點[11]。劉波等[12]將含有大黃蒽醌提取物的飼料投喂建鯉CyprinuscarpiovarJian 70 d后，對魚體進(jìn)行高密度應(yīng)激1 d，發(fā)現(xiàn)各試驗組魚的皮質(zhì)醇、血糖濃度和溶菌酶活性均有不同程度的提高，其中不含大黃提取物的對照組最高；攻毒試驗表明，大黃蒽醌提取物能提高建鯉抗應(yīng)激能力；同樣在高密度中應(yīng)激7 d，也獲得類似結(jié)果，進(jìn)一步證明了大黃提取物在魚類高密度應(yīng)激中的保護作用。王廣軍等[13]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加中草藥免疫添加劑能夠使日本鰻鱺Anguillajaponica的免疫力顯著增強。研究表明，黃芪多糖可有效增強齊口裂腹魚Schizothoraxprenanti非特異性免疫功能[14]，甘草等七味中藥組成的復(fù)方對大菱鲆Scophthalmusmaxima具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，可有效提高大菱鲆的免疫力[15]，茯苓等中草藥組成的復(fù)方可提高施氏鱘非特異性免疫功能[16]。實際生產(chǎn)過程中，一些養(yǎng)殖技術(shù)人員也選擇使用中草藥免疫添加劑來增強水產(chǎn)動物的抗應(yīng)激能力[17]。本試驗中，研究了黃芪、甘草、茯苓3種中草藥對施氏鱘的非特異性免疫功能的影響，旨在篩選出可有效提高施氏鱘免疫力的抗熱應(yīng)激中草藥免疫增強劑。

1 材料與方法

1.1 材料

健康非免疫狀態(tài)下的1+齡施氏鱘由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚繁育技術(shù)工程中心提供，體質(zhì)量為(0.09～0.10) kg。

試驗用中草藥均購自哈藥集團世一堂藥店，烘干粉碎后備用。溶菌酶測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所。嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila(AH)菌株為黑龍江水產(chǎn)研究所鑒定保存菌株，細(xì)菌培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，購自哈爾濱伊事達(dá)生物工程有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 中草藥方劑及藥液的制備 試驗選用黃芪Astragalusmongholicus(Am)、甘草Glycyrrhizauralensis(Gu)、茯苓Poriacocos(Pc) 3種中草藥單方。每種稱取100 g分別放入砂鍋中清水浸泡30 min，小火煎熬45 min，過濾出藥汁，再加水熬30 min，再次過濾，將兩次藥汁合并濃縮成100 mL，其中1 mL藥液相當(dāng)于1 g中草藥方劑(干物質(zhì))的水煎劑，經(jīng)高壓滅菌后存放于冰箱(4 ℃)中備用。

1.2.2 試驗魚的飼養(yǎng)及樣品采集 隨機選取施氏鱘于室內(nèi)水族箱(0.90 m×0.50 m×0.45 m)預(yù)飼兩周，水溫恒定為22 ℃。保持各水族箱養(yǎng)殖條件一致，每天按魚體質(zhì)量的2.0%投喂全價基礎(chǔ)飼料。結(jié)束預(yù)飼后，將黃芪、甘草、茯苓按照0.30、0.24、0.30 g/kg(體質(zhì)量)的劑量每日給試驗魚口灌中草藥水煎劑1次，連續(xù)給藥21 d。給藥結(jié)束后，隨機選取半數(shù)魚放入30 ℃的控溫水族箱中熱刺激2 h，然后與在正常水溫(22 ℃)下的施氏鱘一同取樣。從施氏鱘尾靜脈采血，取全血置于離心管中，并于冰箱(4 ℃)中靜置2 h，待血液凝固后，于4 ℃下以3500 r/min離心10 min，仔細(xì)吸取上層血清于-20 ℃下保存，并取魚鰓、肝、幽門毛囊、胃、腸等組織樣品，立即于-80 ℃下保存。

1.2.3 樣品處理 準(zhǔn)確稱取施氏鱘組織樣品與預(yù)冷的生理鹽水按1 mg∶9 mL的比例稀釋，用組織搗碎機以10 000～15 000 r/min充分研磨制成10%的勻漿，各組織勻漿于4 ℃下以3500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測。血清常溫放置30 min融化后即可檢測。每個檢測指標(biāo)的樣本數(shù)為15尾，均設(shè)3個平行樣。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測 采用Beckman公司生產(chǎn)的CYNCHRON CH4PRO全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。檢測指標(biāo)包括總蛋白、白蛋白、球蛋白含量和白/球蛋白比例。

1.2.5 白細(xì)胞吞噬率測定 將復(fù)蘇保存的嗜水氣單胞菌菌株，于37 ℃基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中搖菌18 h，菌液水浴煮沸10 min后用于白細(xì)胞吞噬的測定[18]，計算公式為

吞噬指數(shù)(PI) =(100個白細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)/參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)),

吞噬率(PP)=100個吞噬細(xì)胞中參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 溶菌酶含量的測定 施氏鱘血清及各組織溶菌酶測定方法參照劉紅柏等[19]的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用鄧肯氏法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氏鱘血清中蛋白含量及白/球蛋白比例的變化

從表1可見：茯苓-常溫組施氏鱘血清中總蛋白含量最高，且顯著高于黃芪-常溫組(P<0.05)；球蛋白和白蛋白含量最高值也出現(xiàn)在茯苓-常溫組；在高溫?zé)釕?yīng)激下，茯苓作用下的施氏鱘血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白含量均較常溫下有所降低；黃芪-常溫組施氏鱘血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白含量及白/球蛋白比例與對照組相比均降低，且為各組最低值。

表1口灌中草藥后施氏鱘血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白含量和白/球蛋白比例的變化(21d)

Tab.1Contentsoftotalprotein,albumin,andglobulin,andtheratioofalbumincontenttoglobulincontentintheserumofAmursturgeonwithoraladministrationofChineseherbalmedicines(21days)

組別group總蛋白/(g·L-1)TP白蛋白/(g·L-1)ALB球蛋白/(g·L-1)GLU白/球蛋白比例A/G對照-常溫 normal temperature control 18.75±1.97ab7.53±1.06a11.23±1.01ab0.67±0.05a對照-高溫 high temperature control 19.33±4.94ab7.53±2.08a11.80±2.90ab0.64±0.05a黃芪-常溫 Aastragalus membranaceus-normal tempera-ture 17.58±2.19a6.63±1.12a10.95±1.16a0.60±0.06a黃芪-高溫 Astragalus membranaceus-high temperature 20.25±1.61ab8.38±0.64a11.88±1.15ab0.71±0.06a甘草-常溫 Glycyrrhiza uralensis-normal temperature 20.38±1.62ab7.85±1.21a12.53±0.71ab0.63±0.09a甘草-高溫 Glycyrrhiza uralensis-high temperature 22.05±3.68ab8.65±1.52a13.40±2.28ab0.65±0.06a茯苓-常溫 Poria cocos-normal temperature 22.85±1.71b8.83±1.47a14.03±0.84b0.63±0.11a茯苓-高溫 Poria cocos-high temperature 19.80±4.06ab7.85±1.57a11.95±2.62ab0.66±0.08a

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2 施氏鱘血清中白細(xì)胞吞噬作用的變化

從表2可見：施氏鱘白細(xì)胞吞噬率最高值出現(xiàn)在對照-常溫組，最低值出現(xiàn)在茯苓-常溫組，甘草-高溫、甘草-常溫、茯苓-常溫組白細(xì)胞吞噬率均顯著低于對照組(P<0.05);甘草-常溫組吞噬細(xì)菌個數(shù)最低，僅為50個左右;高溫?zé)釕?yīng)激下，茯苓和黃芪作用下的施氏鱘血清白細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)。

表2口灌中草藥后施氏鱘白細(xì)胞吞噬作用的變化

Tab.2ChangesinleukocytephagocytosisofAmursturgeonexposedtoChineseherbalmedicines

組別group吞噬率/%PP吞噬細(xì)菌數(shù)/個number吞噬指數(shù)PI對照-常溫DZ-CT22.33±2.19a61.45±8.512.79±0.65a對照-高溫DZ-HT20.78±1.71a74.33±12.533.56±0.32a黃芪-常溫Am-CT19.55±0.69a59.33±6.443.03±0.24a黃芪-高溫Am-HT19.89±2.14a73.56±7.173.72±0.50b甘草-常溫Gu-CT17.11±1.54b50.00±6.442.91±0.21a甘草-高溫Gu-HT18.44±1.39b57.55±5.553.12±0.27a茯苓-常溫Pc-CT16.22±0.69b56.00±6.643.45±0.51a茯苓-高溫Pc-HT19.67±2.91a77.22±24.593.88±0.64b

2.3 施氏鱘各組織中溶菌酶活性的變化

從表3可見：溶菌酶活性在施氏鱘腸中較高；3種中草藥作用下的施氏鱘血清中溶菌酶活性與對照組相比均有所增強；肝中溶菌酶活性最高值出現(xiàn)在甘草-高溫組，為(4.58±0.87)μg/g，且顯著高于其他組(P<0.05)；幽門盲囊中溶菌酶活性較高，黃芪-高溫組幽門盲囊中溶菌酶活性最高,且顯著高于其他組(P<0.05)；胃中黃芪作用下的施氏鱘溶菌酶活性顯著高于對照組(P<0.05)；腸中溶菌酶活性整體偏高，3種中草藥作用下的施氏鱘腸中溶菌酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)；鰓中3種中草藥作用下的施氏鱘溶菌酶活性與對照組相比均顯著升高(P<0.05)。

表3 中草藥對施氏鱘各組織中溶菌酶活性的影響Tab.3 Effects of Chinese herbal medicines on lysozyme activities in different tissues and organs of the Amur sturgeon

3 討論

魚類是一種具有特異性免疫和非特異性免疫的低等脊椎動物，非特異性免疫對防止病原體入侵起著重要作用[20]，具有維護機體健康的重要特性。適度的應(yīng)激對魚類機體有一定益處，但是長時間處于應(yīng)激狀態(tài)則會破壞魚類的免疫系統(tǒng)，皮質(zhì)類固醇的濃度會隨著一系列的反應(yīng)而增加[21]。

3.1 3種中草藥對施氏鱘血清中蛋白含量的影響

水產(chǎn)動物血清中總蛋白含量的變化與肝臟代謝情況密切相關(guān)，當(dāng)魚類體內(nèi)總蛋白含量升高時，白蛋白和球蛋白的含量會隨之增加，魚類體內(nèi)免疫因子則有所增加[22]。血清中總蛋白含量的升高,可能是因為機體大量吸收營養(yǎng)物質(zhì)，代謝加快，蛋白質(zhì)合成旺盛，分泌到血液中的蛋白質(zhì)增多而導(dǎo)致的[23]。白蛋白是血液中含量最多、功能比較復(fù)雜的一種蛋白，對維持機體正常的生理功能具有重要意義。血漿中球蛋白含有的γ-球蛋白可以促進(jìn)魚類機體的免疫功能[24]。本研究表明，常溫條件下，甘草、茯苓對施氏鱘血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白的含量均有提升作用，這表明甘草、茯苓可有效增強施氏鱘免疫功能。高溫?zé)釕?yīng)激條件下，黃芪、甘草、茯苓組與對照組相比蛋白含量均有提高，表明黃芪、甘草、茯苓對施氏鱘抗熱應(yīng)激作用起到一定效果。王荻等[25]自組的中草藥方劑復(fù)方A對施氏鱘血漿中蛋白含量有一定提高作用，可有效提高魚體免疫力，這與本研究結(jié)果相似。

3.2 3種中草藥對施氏鱘白細(xì)胞吞噬功能的影響

白細(xì)胞能夠吞噬動物體內(nèi)衰老及死亡的細(xì)胞和大量的病原微生物。白細(xì)胞吞噬活性在一定程度上可以體現(xiàn)出機體的免疫水平[26]。本研究表明，在常溫條件下，黃芪、甘草、茯苓對白細(xì)胞吞噬指數(shù)均有一定增強作用，高溫應(yīng)激條件下，黃芪、茯苓可顯著提高施氏鱘白細(xì)胞吞噬指數(shù)。常溫條件下，茯苓對施氏鱘吞噬細(xì)菌數(shù)無提升作用，而高溫應(yīng)激條件下，茯苓可有效提高吞噬細(xì)菌數(shù)。這表明，3種中草藥均可一定程度上增強施氏鱘白細(xì)胞吞噬功能，而黃芪、茯苓可促進(jìn)施氏鱘對高溫?zé)釕?yīng)激迅速做出應(yīng)答。

3.3 3種中草藥對施氏鱘相關(guān)組織中溶菌酶活性的影響

溶菌酶是一種水解酶，在血清中主要存在于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和吞噬細(xì)胞。溶菌酶可以水解細(xì)菌細(xì)胞壁，使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部滲透壓不同而破裂。溶菌酶就是通過此途徑來殺滅病原微生物[19]。溶菌酶對魚類來說是較重要的防御因子，可以反映魚類的健康受到哪些病原菌及外界因素的影響[27]。血清中溶菌酶活性與循環(huán)系統(tǒng)中白細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)，白細(xì)胞數(shù)目多，溶菌酶活性就增加[28]。因此，其活性是決定吞噬細(xì)胞殺滅病原菌能力的決定性因素之一[29-30]。本研究表明，常溫條件下，黃芪、甘草、茯苓對施氏鱘血清、幽門盲囊、胃、腸、鰓中溶菌酶活性均有一定增強作用。高溫?zé)釕?yīng)激條件下，黃芪仍對施氏鱘血清、幽門盲囊、胃、腸、鰓中溶菌酶活性有提高作用。表明黃芪在促進(jìn)施氏鱘對高溫應(yīng)激做出有效應(yīng)答上有較好的作用。

4 結(jié)語

本試驗中選取的3種中草藥對施氏鱘血清蛋白含量、白細(xì)胞吞噬能力和部分組織中溶菌酶活性均有一定提高和促進(jìn)作用，其中黃芪可能對魚體抗熱應(yīng)激起到一定作用。