常林瑞，李世順，崔慶奎

(魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264025)

單環(huán)刺螠Urechisunicinctus俗稱海腸，主要分布于俄羅斯、日本、朝鮮和中國渤海灣等，是中國北方沿海泥沙岸潮間帶下區(qū)及潮下帶淺水區(qū)底棲生物的常見種，其中，山東膠東地區(qū)是中國單環(huán)刺螠的最大產(chǎn)地[1]。單環(huán)刺螠肉質(zhì)鮮美，富含蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素，具有良好的營養(yǎng)保健價值，自古以來是中國、日本和朝鮮沿海的名貴海鮮食品[2]。現(xiàn)代分子生物技術(shù)學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，從單環(huán)刺螠體壁中提取的多肽類物質(zhì)和酶類物質(zhì)具有增強機體免疫力、抗腫瘤和溶血栓等功用[4-6]，以單環(huán)刺螠為材料提取生物活性物質(zhì)用于疾病防治有可能成為未來的研究方向。

近年來，由于海岸工程及海洋工程建設(shè)、漁業(yè)生態(tài)環(huán)境污染、過度捕撈等原因，單環(huán)刺螠資源衰退趨勢比較明顯。據(jù)漁業(yè)部門統(tǒng)計，2012年煙臺單環(huán)刺螠的年產(chǎn)量在750 t左右，但仍無法滿足市場需求，從2011到2013年，3年間其價格從每千克20多元漲到140元[3]。由于其較高的經(jīng)濟價值、潛在的藥學(xué)價值，加之對野外資源的過捕，促進了中國單環(huán)刺螠增養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。如山東、遼寧等地對單環(huán)刺螠的繁育[7]、池塘養(yǎng)殖[8-9]、增殖放流[10]進行了較多開創(chuàng)性的工作，但對單環(huán)刺螠的攝食生理學(xué)研究甚少，目前，急需此方面的基礎(chǔ)研究以指導(dǎo)實踐生產(chǎn)。本試驗中，探究了不同餌料、海水鹽度、溫度對單環(huán)刺螠幼體增重率、清濾率和濾食率的影響，旨在為單環(huán)刺螠工廠化養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用單環(huán)刺螠幼體購自東方海洋牟平云溪基地，規(guī)格為1000頭/500 g。帶水運至實驗室后放入底部鋪沙的水族箱中暫養(yǎng)。試驗用水取自煙臺開發(fā)區(qū)，經(jīng)沉淀過濾后使用，暫養(yǎng)期間不間斷充氣，定時投餌清污。

微綠擬球藻Nannochloropsissp.、三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum購自煙臺海融生物技術(shù)有限公司，低溫保存；螺旋藻粉(300 目)購自神康藻業(yè)公司。

1.2 方法

1.2.1 幼螠質(zhì)量的測定 采用帶水稱重法，稱重前將幼螠表面的泥沙沖洗干凈后靜置于托盤內(nèi)，待幼螠全部處于收縮狀態(tài)，自然排出直腸和肛門囊內(nèi)的水分后，將幼螠置于盛水的容器內(nèi)稱重。

1.2.2 不同投喂方式對幼螠生長的影響試驗 將幼螠隨機平均分為3個處理組，每組設(shè)置3個平行，保證幼螠質(zhì)量相當；Ⅰ組僅投喂微綠擬球藻Nannochloropsissp.，Ⅱ組投喂2/3微綠擬球藻和1/3螺旋藻Spirulina，Ⅲ組投喂1/2微綠擬球藻和1/2三角褐指藻PhaeodactylumtricornutumBohlin。各處理組每日早晚各投喂一次，保證總投餌量相當。其他條件及日常管理均相同，飼養(yǎng)兩個月后測定各組幼螠終末體質(zhì)量，并計算增重率：

增重率=(終末總質(zhì)量-初始總質(zhì)量)/初始總質(zhì)量。

1.2.3 幼螠清濾率和濾食率的測定與計算 在實驗室暫養(yǎng)兩月后，對Ⅰ組幼螠進行濾水率和攝食率的測定。在每個試驗桶(6 L)內(nèi)加等量經(jīng)消毒沖洗干凈的沙子，厚度為10 cm，再加過濾海水4 L,每桶內(nèi)隨機放入規(guī)格相近的Ⅰ組10只幼螠，以消除幼體規(guī)格不同對試驗結(jié)果的影響。

溫度試驗中，設(shè)置15、20、25、30 ℃ 4個溫度組，采用500 W加熱棒加熱，將每桶放入培養(yǎng)箱內(nèi)水浴保溫，溫差控制在±0.5 ℃。

鹽度試驗中，用海水晶或淡水調(diào)整鹽度，設(shè)置 20、24、28和32 4個鹽度組，每組設(shè)3個平行。

將試驗幼螠放入各小桶內(nèi)，馴養(yǎng)一周，定時定量投喂微綠擬球藻藻液，等量充氣，定期清污換水。測定前對單環(huán)刺螠幼體進行饑餓處理24 h，再等量投喂微綠擬球藻藻液。另設(shè)一個對照組(不加幼螠)以確定藻類的沉降速率和增長速率，其他條件不變。試驗期間不間斷充氣，以保證有充足的氧氣并使餌料懸浮均勻。先測定餌料微綠擬球藻的初始密度，2.5 h結(jié)束時(在2.5 h內(nèi)幼螠未產(chǎn)生糞便)，從每個試驗桶中取50 mL溶液固定保存于冰箱(4 ℃)中，用于測定餌料的終止密度。

采用餌料濃度差減法測定清濾率和濾食率，主要通過對比攝食和對照瓶中餌料濃度的差異來研究幼體的攝食。 攝食強度按大森信等[12]提出的公式計算:

CR=V×(lnCt- lnCtf)/(N×t),

FR=CR×[(Ctf-Ct)/ (lnCtf- lnCt)]。

其中:CR為清濾率或濾水率[mL/(ind.·h]；FR為濾食率[cells/(ind.·h]；C0為試驗開始時水樣中浮游植物的密度(cells/mL)；Ctf為t時試驗組中浮游植物的密度(cells/mL)；Ct為t時對照組中浮游植物的密度(cells/mL)；V為試驗水樣體積(mL)；N為水樣中試驗個體總數(shù)(ind.)；t為試驗培養(yǎng)時間(h)。

1.2.4 微綠擬球藻濃度的測定 參考涂波等[11]測定微小綠藻濃度的方法,在波長680 nm處測定不同濃度微綠擬球藻的吸光值，以清海水為標準液，用血球計數(shù)板計數(shù)微藻濃度(至少記數(shù)3次)，利用Excel 2010軟件擬合微藻濃度與吸光值之間的一元線性回歸方程。測定試驗前后水樣的吸光度，再根據(jù)方程求出試驗前后微綠擬球藻的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同餌料對幼螠生長的投喂效果

各組單環(huán)刺螠幼體試驗前后體質(zhì)量及兩個月后的增重率統(tǒng)計結(jié)果見表1。單因素方差分析表明，餌料對幼螠的體質(zhì)量和增重率有顯著性影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果表明：投喂微綠擬球藻+三角褐指藻混合餌料和微綠擬球藻+螺旋藻粉混合餌料的兩個試驗組幼螠的增重率顯著高于單純投喂微綠擬球藻試驗組幼螠(P<0.05)，但兩個混合餌料投喂組間幼螠的增重率無顯著性差異(P=0.17)。

表1試驗前后幼螠體質(zhì)量及增重率

Tab.1Bodyweightandweightgainrateofjuvenileechiuranwormatthebeginningandendoftheexperiment

組別group 初始體質(zhì)量/ginitial body weight試驗?zāi)w質(zhì)量/gfinal body weight增重率weight gain rateⅠ50.18±0.04a85.46±1.09a0.70±0.02aⅡ50.17±0.10a111.50±1.10bc1.22±0.02bcⅢ50.19±0.11a113.14±0.65bc1.25±0.01bc

注：同列中標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2 藻液濃度測定結(jié)果

當微綠擬球藻濃度為2.35×105～7.34×107cells/mL時，在波長680 nm處檢測微綠擬球藻濃度(X)與吸光值(Y)間有良好的線性關(guān)系，其擬合方程為Y=0.225X-0.0201 (R2=0.9997)。

2.3 鹽度對幼螠清濾率和濾食率的影響

單因素方差分析表明，鹽度對單環(huán)刺螠幼體的清濾率和濾食率有顯著性影響(P<0.05)。從表2可見：在試驗鹽度范圍內(nèi)時，清濾率和濾食率隨鹽度升高均呈先升高后降低的變化趨勢；當鹽度為28時，清濾率和濾食率均最高，分別為(262.16±3.90)mL/(ind.·h)和(123.41±0.740)×104cells/(ind.·h)，且顯著高于其他鹽度組(P<0.05)；各鹽度組間清濾率和濾食率均有顯著性差異(P<0.05)。

表2鹽度對幼螠淸濾率和濾食率的影響

Tab.2Effectsofsalinityontheclearancerate(CR)andfilteringrate(FR)ofjuvenileechiuranworm

鹽度salinity清濾率CR/(mL·ind.-1·h-1)濾食率 FR/(104 cells·ind.-1·h-1)2043.28±0.99a37.56±2.11a2468.02±2.27b52.84±1.45b28262.16±3.90d123.41±0.74d32208.79±4.87c115.52±1.27c

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，鹽度與清濾率和濾食率間均呈正相關(guān)，鹽度對清濾率的相關(guān)系數(shù)為0.836，對攝食率的相關(guān)系數(shù)為0.888，清濾率與濾食率間的相關(guān)系數(shù)為0.994?？梢?，鹽度是影響單環(huán)刺螠攝食的重要生態(tài)因子。

2.4 溫度對幼螠清濾率和濾食率的影響

單因素方差分析表明，溫度對幼螠的清濾率、濾食率有顯著性影響(P<0.05)。從表3可見：在試驗設(shè)定溫度范圍內(nèi)，濾水率和攝食率隨水溫的升高均呈先升高后降低的變化趨勢；當溫度為20 ℃時幼螠的清濾率最高，為(251.33±10.16) mL/(ind.·h)，溫度為25 ℃時幼螠的濾食率最高，為(159.11±4.35)×104cells/(ind.·h)，這表明，水溫20～25 ℃是幼螠適宜的濾食溫度；20 ℃、25 ℃時，幼螠的清濾率和攝食率與低溫15 ℃、高溫30 ℃時均有顯著性差異(P<0.05)，這也說明溫度20～25 ℃是單環(huán)刺螠幼體的最佳攝食溫度。

表3溫度對幼螠清濾率和濾食率的影響

Tab.3EffectsofseawatertemperatureontheCRandFRofjuvenileechiuranworm

水溫/℃temperature清濾率CR/(mL·ind.-1·h-1)濾食率 FR/(104 cells·ind.-1·h-1)1580.07±6.68a70.63±0.78a20251.33±10.16b130.19±5.33b25218.60±3.07b159.11±4.35b30155.27±12.17a83.19±2.11a

3 討論

3.1 混合投喂可以促進幼螠的生長

本研究中，利用單純綠藻和混合藻(粉)(綠藻與三角褐指藻混合、綠藻與螺旋藻混合)兩種方法進行投喂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，投喂混合藻(粉)幼螠的增重率明顯高于投喂單獨藻類。微綠擬球藻和三角褐指藻混合投喂起著營養(yǎng)互補的作用，可以明顯促進水產(chǎn)動物的生長。螺旋藻粉在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，不僅能促進養(yǎng)殖動物的生長、攝食,還具有增強機體免疫力、提高幼體存活率和改善品質(zhì)與體色等效果[13]。因此，在今后單環(huán)刺螠人工配合飼料的研發(fā)中可適當添加螺旋藻粉。

孫濤等[14]對單環(huán)刺螠攝食節(jié)律的研究中，所用飼料為粉末狀商品配合飼料，也說明懸浮的飼料顆粒可被單環(huán)刺螠濾食。因此，在進行單環(huán)刺螠的池塘增養(yǎng)殖時，不僅要重視池塘中多種有益藻類和小型浮游動物的培養(yǎng)，在不影響水質(zhì)的條件下，還可以適當補充一些營養(yǎng)全面、口徑合適的顆粒類飼料，溶于水后進行潑灑投喂。

3.2 分光光度計法測定藻類濃度的可行性

本研究中利用血球計數(shù)板測定了微綠擬球藻的原始濃度，再采用分光光度計法測定不同濃度藻類的吸光值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定的濃度范圍內(nèi)，吸光值與藻液濃度呈一元線性回歸關(guān)系，可擬合得到一元線性回歸方程，用該方程可以快速計算藻液的濃度。如果直接用血球計數(shù)板進行藻類濃度的計數(shù)，這種方法雖相對直接，但存在主觀誤差，需要多次計數(shù)消除。由于研究過程中同時計數(shù)的樣品較多，如果采用這種方法會耗費大量時間，結(jié)果也容易受到藻液沉降的影響。涂波等[11]的試驗表明，680 nm波長處可以準確靈敏測定小球藻的藻液吸光值，因此，在研究單環(huán)刺螠攝食強度時利用分光光度計法進行藻類濃度的測定，這種方法操作簡便、快捷，而且由于操作時間短，可以有效避免藻液沉降、繁殖、死亡對藻液濃度測定的影響。

3.3 鹽度和溫度對幼螠攝食的影響

單環(huán)刺螠生活在潮間帶及潮下帶沙質(zhì)海底的“U”形管道內(nèi)，由于受海水漲落的影響，單環(huán)刺螠對鹽度和溫度有較大的耐受性。李諾等[15]研究表明，單環(huán)刺螠生活的溫度范圍為-2～31 ℃，鹽度范圍為15～36。王力勇等[16]對體質(zhì)量67～115 g的單環(huán)刺螠進行耐受性研究表明：單環(huán)刺螠在水溫為20～26 ℃時，狀態(tài)正常、攝食旺盛；對鹽度的適宜范圍為19～35，當鹽度低于19或高于35時，攝食量均明顯降低。在本試驗設(shè)置的鹽度溫度范圍內(nèi)，單環(huán)刺螠均未出現(xiàn)明顯的應(yīng)激反應(yīng)或死亡，說明單環(huán)刺螠對溫度和鹽度具有廣泛的適應(yīng)性。

清濾率和濾食率是反映水生生物攝食生理變化的動態(tài)指標，本研究表明，鹽度和溫度的變化對單環(huán)刺螠的清濾率和濾食率均有顯著影響。鹽度影響動物體的滲透壓，溫度影響動物體內(nèi)消化酶的活性。幾乎對所有的濾食貝類[17-19]、水蚤[20-21]、刺參[22]、邁氏軟苔蟲[23]、中國對蝦[24]的攝食生理研究發(fā)現(xiàn)，在適宜的溫度、鹽度范圍內(nèi)，清濾率和濾食率隨溫度、鹽度的升高而增加，當達到一定值后，隨著溫度、鹽度的升高，其清濾率和濾食率不再升高反而下降?？梢姡}度和溫度是影響水生生物攝食活動重要的物理因子。

包永波等[25]認為，鹽度和溫度對濾食性貝類攝食生理生態(tài)的影響顯著。濾食性貝類纖毛擺動的頻率和溫度成正比，這是導(dǎo)致攝食率變化的主要原因。單環(huán)刺螠吻的表面密生纖毛并形成許多縱行皺壁，相鄰皺壁構(gòu)成半管狀的食物溝，由于纖毛擺動形成的水流將食物顆粒沿食物溝導(dǎo)入口內(nèi)[26]。在本試驗水溫范圍內(nèi)，低溫(15 ℃)和高溫(30 ℃)時的清濾率(80.07±6.68、155.27±12.17)均顯著低于20、25 ℃時(251.33±10.16、218.60±3.07)。從基本概念上分析，清濾率是指濾食性生物在單位時間內(nèi)濾食懸浮總顆粒物時所濾過的水體積[17]，它更大程度上與濾食生物濾器纖毛的擺動頻率有關(guān)。因此，從本研究結(jié)果可以推測，溫度變化影響單環(huán)刺螠吻部纖毛擺動的頻率，進而影響水流速度，對幼螠攝食單胞藻類的濾食率產(chǎn)生影響。

包永波等[25]在探討鹽度對濾食貝類攝食活動的影響中認為，低鹽環(huán)境導(dǎo)致貝類關(guān)閉貝殼或水管，降低與外界的水流交換，保護機體不受低鹽度造成的傷害，引起貝類濾水和攝食活動的下降；高鹽環(huán)境中，貝類自身的調(diào)節(jié)能力不能平衡海水滲透壓的改變，從而引起濾水和攝食活動的下降。在本試驗設(shè)置的低鹽(鹽度為20、24)和高鹽(鹽度為32)環(huán)境下，幼螠的清濾率和濾食率顯著低于鹽度28時。因此，在不適的鹽度條件下，單環(huán)刺螠也有類似于貝類的保護機制。作者在本實驗室內(nèi)也觀察到，在正常情況下，單環(huán)刺螠吻部翻卷的頻率為每分鐘28±2次，在高鹽或低鹽的水環(huán)境條件下，吻翻卷的頻率降為20次以下。這說明，鹽度不適可以明顯降低吻翻卷的頻率，從而引起清濾率和濾食率的降低。

鄭巖等[27]的研究發(fā)現(xiàn)：單環(huán)刺螠幼螠生存水溫不能超過31.6 ℃，否則會導(dǎo)致幼螠死亡；幼螠生存的鹽度為13.8～35.9,適宜鹽度為20.8～35.2。本研究表明，在鹽度為20～28，溫度為15～25 ℃時，幼螠清濾率和濾食率隨鹽度、溫度增加而增加，本試驗中未進行溫度和鹽度對幼螠攝食交叉影響研究，但也從另一側(cè)面驗證了單環(huán)刺螠幼體攝食的最適鹽度為28，最適水溫為20～25 ℃。

雖然影響攝食生理的因素較多，比如研究對象個體規(guī)格、餌料種類及其濃度、海水的pH值等，但作為一種新的養(yǎng)殖品種，人們對單環(huán)刺螠的攝食生理學(xué)還未開展系統(tǒng)的研究，本試驗結(jié)果可以為單環(huán)刺螠的池塘養(yǎng)殖技術(shù)提供一定的參考。