張富勇，蘇 建，劉 陽，安明哲

（四川宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644000）

濃香型白酒生產過程中，入窖發(fā)酵糟醅的含水量為52%～55%，隨著發(fā)酵的進行，糟醅中的營養(yǎng)物質在微生物和酶的作用下分解轉化，生成的水與糟醅中原有的水分沉積、匯聚于窖池底部，發(fā)酵結束后起糟操作時，通過打坑、開槽將水分滲出，采用泵或者人工舀出，此類液體一般呈黃褐色，生產上稱為黃水。黃水中通常含有1%～2%的殘余淀粉，0.3%～0.7%的殘?zhí)牵?%～5%的乙醇，以及有機酸、白酒香味成分及前體物質等，具有較高的利用價值[1]。

目前對黃水的研究大多局限在呈香呈味物質的提取利用，尚未有對黃水抗氧化活性及相關物質的報道。眾所周知，國內外對葡萄酒、黃酒和啤酒的抗氧化活性及功能性物質的研究常有報道。目前國內對白酒的抗氧化活性及健康因子的研究日益趨熱，但因白酒屬于蒸餾酒，蒸餾導致白酒抗氧化活性較低、白酒中抗氧化物質含量較少[2]。本研究通過利用DPPH自由基清除法及總抗氧化測定對黃水的抗氧化活性進行測定，對初步分離得到的黃水粗多糖及黃水清液進行抗氧化活性測定，探索黃水抗氧化活性的分布。為今后進一步資源化利用黃水中的抗氧化活性物質提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

黃水、濃香型白酒，五糧液酒廠；黃酒，紹興產黃酒；沒食子酸、維生素C，國藥集團；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Folin-酚試劑，美國sigma公司。

離心機5810R、分光光度計，美國Eppendorf公司；旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化廠；冷凍干燥儀，德國德蒙christ冷凍干燥機。

1.2 方法

1.2.1 黃水DPPH自由基清除能力的測定

參照沈赤等[3]的方法，配制0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液、1 g/L的維生素C、沒食子酸溶液，避光4℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用?？瞻妆壬苤屑尤? mL超純水，100 μL待測樣品，混勻。最后向上述體系中準確加入2 mL DPPH自由基溶液，充分混勻。于室溫避光靜置30 min后，在517 nm處測定吸光值變化。用1 g/L沒食子酸和維生素C作為陽性對照，白酒和黃酒作為參照。按下式計算清除率：清除率（%）=（1-A1/A0）×100 ；其中：A1為待測樣存在時的吸光度；A0為對照樣的吸光度。

1.2.2 黃水總抗氧化能力的測定

參照王曉宇等[4]使用的亞油酸體系，準確量取2.5 mL K3PO4緩沖液（0.04 mol/L，pH7.0）和2.5 mL亞油酸乳狀液于5 mL比色管中，混勻。向上述體系中加入200 μL待測樣，充分混勻。將混合反應液放入37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每12 h取樣100 μL，共取5次。用硫氰酸鹽法檢測反應體系的氧化程度。檢測方法：取樣品溶液100 μL加入到4.7 mL乙醇（75%vol）中，然后加入100 μL硫氰酸銨（30%）和100 μL FeCl2（濃度為20 mmol/L，溶于3.5%HCl中）混勻，在500 nm處測定吸光值變化。用2.5 mL的K3PO4緩沖液與2.5 mL的亞油酸乳狀液混合作空白對照，用1 g/L Vc、沒食子酸作為陽性對照，用白酒和黃酒作為參照。

按下式計算氧化抑制百分率：氧化抑制率（%）=（1-A1/A0）×100；其中：A1為待測酒樣存在時的吸光度；A0為對照樣的吸光度。

1.2.3 黃水粗多糖的制備及抗氧化活性測定

黃水粗多糖的制備參照紹興黃酒多糖提取的方法[5]并進行改進，取400 mL新鮮黃水進行減壓濃縮、濃縮至100 mL（即濃縮比為4.0），乙醇濃度為80%vol、醇沉時間為24 h、醇沉溫度為4℃，離心收集多糖，將收集得到的粗多糖進行凍干，計算黃水粗多糖得率；將得到的黃水粗多糖用去離子水還原至400 mL，并測定其DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力。

1.2.4 黃水除多糖后清液（醇沉液）的抗氧化活性及總酚測定

對醇沉離心后所得的上清液進行減壓濃縮、揮發(fā)去除用于醇沉的乙醇，將上清液體積控制在100 mL左右，并用去離子水還原至黃水原體積（400 mL）即為黃水清液，測定其DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力，同時測定黃水清液中總酚的含量，總酚測定采用Folin-Ciocalteu法測定[6]。

2 結果與分析

2.1 黃水DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種以氮為中心的有機自由基，其性質穩(wěn)定、呈深紫色，在517 nm處的吸收較強。當抗氧化物質提供的電子與DPPH電子配對時，溶液顏色變淺，517 nm處的吸收消失，反映了自由基被清除的情況，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關系。因此，可以較迅速地評價物質的抗氧化能力。測定結果如圖1所示：在相同條件下，100 μL Vc、沒食子酸、白酒、黃酒和黃水對DPPH的清除率分別是65.4%、78.0%、9.2%、43.7%、55.7%。結果表明，黃水的DPPH自由基清除能力較強甚至強于黃酒，但白酒的DPPH自由基清除能力較弱。這與文獻報道的DPPH自由基清除率為“啤酒＞葡萄酒＞黃酒＞白酒”基本一致[7]。

2.2 總抗氧化能力

總抗氧化能力是通過樣品對亞油酸的自氧化作用的抑制來測定的。在亞油酸的自氧化過程中，會產生過氧化物。這些過氧化物會將Fe2+氧化為Fe3+，F(xiàn)e3+與SCN-形成絡合物，于500 nm處有最大吸光值。因此，吸光值越高，表明亞油酸自氧化的程度越高。加入待測樣品后，通過硫氰酸鹽法測定的亞油酸自氧化程度的吸光值。測定結果如圖2所示：100 μL Vc、沒食子酸、白酒、黃酒和黃水，反應時間為60 h時，氧化抑制率分別為76.7%、90.1%、10.3%、45.6%、63.8%。結果表明，亞油酸體系測定的上述樣品氧化抑制率普遍高于DPPH自由基清除率，且氧化抑制率強弱程度與DPPH自由基清除率相一致。同時表現(xiàn)出黃水的抗氧化能力較強，甚至強于黃酒，明顯高于白酒，也與現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)的黃酒氧化抑制率[8]為60%～99%相一致。

圖1 黃水及參照物的DPPH自由基清除率

圖2 黃水及參照物的總抗氧化力

2.3 黃水粗多糖的制備及抗氧化活性測定

參照紹興黃酒多糖提取的方法并進行改進：濃縮比為4.0，乙醇濃度為80%vol、醇沉時間為24 h、醇沉溫度為4℃，離心收集多糖，400 mL新鮮黃水經醇沉提取、冷凍干燥后得到1.64 g黃水粗多糖，得率為0.41%。將凍干的黃水粗多糖用去離子水再溶至400 mL后測得的抗氧化能力如圖3所示：黃水粗多糖的DPPH自由基清除率為18.1%、氧化抑制率為31.3%，這說明經過醇沉得到的黃水粗多糖在功能上類似于植物多糖，但抗氧化能力仍略低于文獻報道的紹興黃酒多糖200 mg/L的53%氧化抑制率?？梢栽诤罄m(xù)的試驗中對黃水粗多糖進行濃縮、精制，進一步研究提升黃水多糖的抗氧化功效。

圖3 黃水粗多糖抗氧化能力

2.4 黃水除多糖后清液（醇沉液）的抗氧化活性及總酚測定

對醇沉離心后所得的上清液進行減壓濃縮、揮發(fā)除去加入的乙醇，將上清液體積控制在100 mL左右，并還原至黃水體積（400 mL）制備成黃水清液，測定其DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力，結果見圖4。黃水清液的DPPH自由基清除率達到31%、氧化抑制率為38.9%，較高于黃水粗多糖，具有較為明顯的抗氧化能力。同時采用Folin-Ciocalteu法測定清液中總酚的含量為480 mg/L，接近于相關文獻報道的黃酒總酚含量400～900 mg/L，進一步印證了黃水清液的抗氧化能力。

圖4 黃水清液抗氧化能力

2.5 黃水抗氧化能力的分布

通過減壓濃縮、醇沉多糖等操作將新鮮黃水分離成黃水粗多糖和黃水清液兩個組分，分別對兩個組分進行再溶、還原至原黃水體積以便更為直觀的與原黃水對比，兩組分與黃水的DPPH自由基清除效果及總抗氧化能力如圖5所示。黃水的抗氧化活性在黃水粗多糖及黃水清液中均有分布和體現(xiàn)，但主要分布于黃水清液中。造成黃水抗氧化活性分布特性原因主要與白酒的生產方式有關，白酒生產一般采用以單糧或多糧為原料，利用酒曲中的多種微生物共同作用，經陳年泥窖長期發(fā)酵而成。原料中未被利用的多糖、維生素類、酚類等化合物以及長期缺氧發(fā)酵代謝過程中產生的微生物多糖、還原性物質等，這些物質依附于糟醅進入水相環(huán)境，由于不易揮發(fā)從而被保留在黃水中。實驗中測定的黃水粗多糖及總酚可以說明黃水的抗氧化能力，但是其他存在于黃水中的抗氧化物質，如氨基酸、小分子肽類、烯萜類也有可能具有抗氧化作用，具體成分尚待進一步研究，為拓寬白酒抗氧化活性物質、提升白酒健康功效提供支撐。

圖5 黃水抗氧化能力分布

3 結論

通過DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力兩種指標間接測定黃水及分離的黃水兩大組分。研究結果表明，黃水中含有的組分具有明顯強于白酒的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力，蒸餾是導致白酒抗氧化能力偏低的主要原因，表明具有抗氧化活性的物質難以揮發(fā)；黃水的抗氧化活性物質主要分布在黃水清液中，但黃水多糖仍有一定的抗氧化能力。初步推測，酚類化合物是引起黃水抗氧化活性的主要物質，然而由于黃水經過長時間缺氧發(fā)酵其成分極為復雜、存在多種類型的還原性物質，具體是哪一種抗氧化活性成分、哪些是可以高效利用，尚待今后進一步的深入研究。