金 潔 任躍忠 林海洋

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江 杭州 310009)

甲狀腺癌根據(jù)組織發(fā)生和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為乳頭狀腺癌、濾泡性癌、髓樣癌和未分化癌，其中乳頭狀腺癌最常見(jiàn)〔1,2〕。目前，關(guān)于甲狀腺癌的診斷和治療手段比較單一，且治療效果并不理想。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)通過(guò)與下游基因mRNA互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致靶基因mRNA降解和蛋白翻譯受阻的內(nèi)源性小分子RNA，大量研究顯示miRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3,4〕。miR-124在胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等多數(shù)腫瘤中具有抑癌作用，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡過(guò)程中具有重要作用〔5～7〕，但其對(duì)甲狀腺癌的作用機(jī)制尚不清晰。本文擬分析miR-124對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器 正常甲狀腺細(xì)胞系Nthy-ori3-1和甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系SW579由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素和RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

Has-miR-124 mimics、Has-miR-124 mimics NC和PCR擴(kuò)增引物購(gòu)于廣州銳博公司。RNAiso Plus試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量檢測(cè)試劑盒、膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒和放射免疫沉淀(RIPA)細(xì)胞裂解液為上海碧云天公司產(chǎn)品。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、蛋白激酶B(AKT)抗體、磷酸化AKT(p-AKT)抗體、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α(PIK3CA)、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體和辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗為美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)箱、PCR儀和流式細(xì)胞儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取儲(chǔ)存在液氮罐中的Nthy-ori3-1細(xì)胞和SW579細(xì)胞，迅速置于溫度為37℃的水浴鍋中融化復(fù)蘇。向收集到的細(xì)胞懸液中加入含有10%FBS、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞成長(zhǎng)完全貼壁后，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR檢測(cè) 收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Nthy-ori3-1細(xì)胞和SW579細(xì)胞，采用RNAiso Plus試劑盒提取兩種細(xì)胞的總蛋白。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-124上游引物為5′-TTTTAAGGCACGCGGTG-3′，下游引物為5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。其中，PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(共35個(gè)循環(huán))；72℃總延伸300 s。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-124的表達(dá)水平，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，收集培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW579細(xì)胞，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-124模擬組?？瞻讓?duì)照組不做任何處理，陰性對(duì)照組加入Has-miR-124 mimics NC和Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-124模擬組加入Has-miR-124 mimics和Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作步驟按照Lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4轉(zhuǎn)染效果檢測(cè) 上述各組SW579細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后，更換1次培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。收集空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-124模擬組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照1.2.2中的操作步驟觀(guān)察各組細(xì)胞中miR-124的表達(dá)水平，檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5Western印跡檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-124模擬組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，根據(jù)BCA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞總蛋白的濃度和純度。以每孔蛋白樣品30 μg上樣至濃度為10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中，電泳完畢后，經(jīng)轉(zhuǎn)印、封閉后加入Bax抗體(1∶800稀釋)、Bcl-2抗體(1∶800稀釋)、AKT抗體(1∶1 000稀釋)、p-AKT抗體(1∶1 000稀釋)、PIK3CA抗體(1∶1 000稀釋)和β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，在4℃條件下孵育24 h后，加入二抗(1∶2 000稀釋)，常溫條件下反應(yīng)2 h后，以化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光，采用凝膠電泳成像儀分析。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-124模擬組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml后接種至6孔板中，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌、離心。每組取1 ml細(xì)胞，洗滌離心后加入200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每100 μl分別加入Annexin V、PI體積為5 μl和10 μl，混勻后避光條件下反應(yīng)10 min，再加入400 μl結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-124在甲狀腺癌SW579細(xì)胞中的表達(dá) miR-124在正常甲狀腺Nthy-ori3-1細(xì)胞中的表達(dá)量(1.02±0.03)明顯高于在SW579細(xì)胞中(0.32±0.05；t=20.793，P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染Has-miR-124 mimics上調(diào)SW579細(xì)胞中miR-124表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，與空白對(duì)照組(1.05±0.12)相比，miR-124模擬組中miR-124的相對(duì)表達(dá)量(5.18±0.35)顯著升高(P<0.05)，而與陰性對(duì)照組(1.12±0.16)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3上調(diào)miR-124表達(dá)誘導(dǎo)SW579細(xì)胞凋亡 3組凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.463，P=0.000)。與空白對(duì)照組(6.58%±1.32%)相比，miR-124模擬組中SW579細(xì)胞凋亡率(22.65%±2.36%)顯著升高(P<0.05)，而陰性對(duì)照組(7.15%±1.86%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4上調(diào)miR-124表達(dá)對(duì)PIK3CA、AKT、p-AKT、Bcl-2及Bax表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，miR-124模擬組中PIK3CA、p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著降低，Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而AKT蛋白表達(dá)量變化不明顯(P>0.05)；陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組PIK3CA、AKT、p-AKT、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 上調(diào)miR-124表達(dá)對(duì)PIK3CA、AKT、p-AKT、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

3 討 論

miR-124是一個(gè)最初由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而來(lái)的高度保守miRNA。人類(lèi)成熟miRNA-124是由分別位于8p23.1染色體上的pre-miR-124-1、8q12.3染色體上的pre-miR-124-2和20q12.3染色體上的pre-miR-124-3剪切而來(lái)〔8，9〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124在多數(shù)腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)，與多種腫瘤的預(yù)后診斷和治療密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵染、轉(zhuǎn)移和凋亡等生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用〔10，11〕。Dong等〔10〕研究指出，miR-124在乳腺癌中表達(dá)下降與乳腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。Zhang等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-124在肺癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，miR-124低表達(dá)組中肺癌患者5年內(nèi)生存率明顯縮短。有研究發(fā)現(xiàn)，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中干擾miR-124 表達(dá)后，細(xì)胞增殖和克隆形成明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率顯著升高〔12〕?；謴?fù)miR-124在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，能夠通過(guò)靶向EZH2基因抑制胃癌細(xì)胞增殖和克隆形成，且與5-氟尿嘧啶聯(lián)合抗胃癌效果更佳〔13〕。甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，與多種miRNAs的異常表達(dá)密切相關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-124在甲狀腺癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，且干擾miR-124表達(dá)，可通過(guò)調(diào)控STAT3基因的表達(dá)影響K1細(xì)胞的增殖和侵襲〔14〕。

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)重要的生命活動(dòng)，在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展、預(yù)后和產(chǎn)生耐藥性過(guò)程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞凋亡是由多種基因和蛋白共同調(diào)控的結(jié)果，Bcl-2家族蛋白通過(guò)直接或間接作用于線(xiàn)粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax作為Bcl-2家族蛋白中的重要成員，在包括甲狀腺癌等多種腫瘤組織中異常表達(dá)，與甲狀腺癌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔15，16〕。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號(hào)通路在炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，通過(guò)上游分子與PI3K結(jié)合，磷酸化激活A(yù)KT，使PI3K/AKT信號(hào)通路活化參與腫瘤的調(diào)控。PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)基因或分子異常表達(dá)所引起的功能獲得或缺失與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡等生物學(xué)特性轉(zhuǎn)變密切相關(guān)〔17〕。PIK3CA是PI3K/AKT信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，作為一種癌基因在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，與腫瘤的診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)〔18，19〕。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-124能夠通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路在缺血性腦卒中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；過(guò)表達(dá)miR-124通過(guò)下調(diào)PIK3CA表達(dá)抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖；miR-124能夠抑制甲狀腺功能減退大鼠中海馬神經(jīng)元凋亡，其作用機(jī)制與下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)〔20～22〕。本研究結(jié)果提示，miR-124可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活性，上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2表達(dá)誘導(dǎo)甲狀腺癌SW579細(xì)胞凋亡。

綜上，miR-124在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，過(guò)表達(dá)miR-124能夠誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活性，上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。