田培燕 余躍生 鄧祖國 陳應(yīng)康 祝 星

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000)

飛龍掌血是蕓香科飛龍掌血屬(Toddalia)植物飛龍掌血的根或根皮，全年可采挖。飛龍掌血最早收載于《植物名實圖考》，味苦，性冷，具有消腫解毒，祛風(fēng)除濕的功效。在我國主要分布在貴州、云南和四川等西南省份，是典型的苗族藥物〔1，2〕。苗族民間將飛龍掌血的根或根皮的水煎液或藥酒治療跌打損傷和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，動物研究也顯示飛龍掌血具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎活性〔3，4〕。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(AGA)的臨床癥狀在于關(guān)節(jié)處紅、腫、熱和痛，嚴(yán)重者可致關(guān)節(jié)變形，臨床常用糖皮質(zhì)激素或秋水仙堿緩解其癥狀，但這兩類藥物容易引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致炎癥復(fù)發(fā)〔5〕。本文探討飛龍掌血對鼠AGA治療作用及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 SPF級大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(瑜)〔2007-0006〕。

1.2受試藥 飛龍掌血購于遵義市中藥材批發(fā)市場。由黔南民族醫(yī)專魏學(xué)軍教授鑒定為飛龍掌血干燥根。取干燥至恒重的飛龍掌血藥材1 kg，采用70%乙醇溶液進(jìn)行提取，回流提取2次，每次溶劑的體積為所用藥材的12、10倍，分別提取2、1 h，合并2次提取液，減壓過濾。秋水仙堿(云南省玉溪望子隆生物制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H53021904，規(guī)格：0.5 mg/片)。

1.3儀器與試劑 N4紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；DB027型鼠尾光照測痛儀(北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司)。尿酸晶體(美國Sigma公司)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒均購自貴州明涵生物科技有限公司。

1.4制備AGA大鼠模型 將大鼠固定于自制大鼠架上，暴露右側(cè)踝關(guān)節(jié)，依次采用碘伏及醫(yī)用酒精消毒皮膚表面，以45°在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)插至脛跗關(guān)節(jié)腔，緩慢注射(5%)尿酸鈉0.1 ml。

1.5分組和給藥 將AGA大鼠隨機(jī)分為5個組：模型組、秋水仙堿組(0.3 mg/kg)、飛龍掌血低、中、高劑量組(1、2、4 g/kg)，將正常大鼠同樣部位注射0.9%氯化鈉注射液0.1 ml為對照組，所有組別灌胃給藥，對照和模型組給予生理鹽水，給藥體積20 ml/kg，1次/d，10只/組，連續(xù)給藥10 d。

1.6步態(tài)評分 給藥1、5、10 d對步態(tài)進(jìn)行評分：0分：行走正常；2分：輕微跛行，右下肢微彎；4分：中度跛行，右下肢剛可觸地面，6分：重度跛行，僅能3足行走，右下肢難以觸及地面。分?jǐn)?shù)越高，步態(tài)越差。

1.7足趾腫脹體積 給藥1、5、10 d測量大鼠踝關(guān)節(jié)體積，采用自制足趾腫脹體積裝置測量大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)體積。

1.8痛閾 給藥1、5、10 d記錄動物痛閾。在20℃環(huán)境下，固定大鼠，采用鼠尾光照測痛儀，使大鼠雙后肢暴露在燈下，雙后肢距燈約3 cm，記錄自照射至大鼠縮腿反應(yīng)的時間。

1.9外周血炎癥因子 給藥結(jié)束后2 h，斷尾法取血，離心得血清，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)，嚴(yán)格按照試劑盒說明檢測血清的IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.10逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp6表達(dá) 給藥結(jié)束，處死大鼠，切開大鼠膝關(guān)節(jié)前側(cè)髕前韌帶髕骨下緣，分離髕下脂肪墊，得到關(guān)節(jié)滑膜，用10%甲醛溶液固定48 h，制作病理切片，行免疫組化染色。

1.11關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá) RNA提取 于10 d給藥后2.5 h，處死大鼠，游離大鼠右后肢關(guān)節(jié)滑膜組織，稱取50 mg，液氮研磨，加1 ml TRIzol 勻漿，離心去除未裂解組織。加0.2 ml氯仿，振蕩均勻，離心取上清。加0.5 ml 異丙醇，離心去上清。加1 ml 75%乙醇，離心去上清，干燥得RNA。加 25 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水，-80℃?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)在EP管中，加入3 μg總RNA、1 μl 10 μmol/L Oligo，以DEPC水補(bǔ)至 12 μl。PCR儀上65℃加熱5 min，冰浴3 min。在EP管加4.0 μl 5×反應(yīng)緩沖液、2 μl 10 mmol/L dNTP混合物、1 μl反式TM M-Mu LV反滲透液和1 μl RNA酶抑制劑，70℃ 5 min，得cDNA。取1 μl cDNA為熒光定量模板，反應(yīng)體系：5 μl 2×核酸染料，1 μl 10 μmol/L正向引物，1 μl模板DNA，1 μl 10 μmol/L反向引物和2 μl無RNA酶水。95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參。IL-1β、IL-6和TNF-α序列見表1。

表1 IL-1β、IL-6和TNF-α的序列

1.12大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織 NF-κBp65 的表達(dá)于10 d給藥后，取患肢的滑膜組織，并制成石蠟切片，滴加正常山羊血清封閉液，滴加Ι抗 PBS 50 μl/片，4℃過夜，在 37℃復(fù)溫10 min，PBS洗滌，滴加Ⅱ抗PBS 50 μl/片，37℃ 30 min，PBS洗滌，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡下查看。

1.13統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行F、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組步態(tài)評分比較 與對照組比較，造模后1、5、10 d模型組步態(tài)評分明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，飛龍掌血各組及秋水仙堿組步態(tài)評分均有不同程度降低(P<0.05)，呈時間-劑量依賴性關(guān)系，見表2。

2.2各組足趾腫脹體積比較 與對照組比較，造模后1、5、10 d模型組足趾腫脹體積明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，飛龍掌血各組、秋水仙堿組足趾腫脹體積均有不同程度降低(P<0.05)，呈時間-劑量依賴性關(guān)系，見表3。

表2 各組步態(tài)評分比較(n=10，分，

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與低劑量組比較：3)P<0.05；與中劑量組比較：4)P<0.05；與1 d比較：5)P<0.05；下表同

表3 各組足趾腫脹體積比較

2.3各組痛閾比較 與對照組比較，造模后1、5、10 d模型組痛閾明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，飛龍掌血各組、秋水仙堿組痛閾均有不同程度增高(P<0.05)，呈劑量依賴性關(guān)系，見表4。

2.4各組外周血IL-1β、IL-6和TNF-α、關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65比較 與對照組比較，模型組外周血炎癥因子和關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65明顯增高(P<0.05);與模型組比較，飛龍掌血各組、秋水仙堿組外周血炎癥因子和關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65均有不同程度降低(P<0.05)，呈劑量依賴性關(guān)系，見表5和圖1。

表4 各組痛閾比較

表5 各組外周血IL-1β、IL-6和TNF-α、關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65表達(dá)比較

圖1 各組關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κBp65表達(dá)(免疫組化，×200)

2.5各組關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)比較 與對照組比較，模型組關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，飛龍掌血各組及秋水仙堿組關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA均有不同程度降低(P<0.05)，呈劑量依賴性關(guān)系，見圖2和表6。

1.對照組，2.模型組，3.飛龍掌血低劑量組，4.飛龍掌血中劑量組，5.飛龍掌血高劑量組，6.秋水仙堿組圖2 各組關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)

組別IL-1βIL-6TNF-α對照組0.21±0.110.21±0.110.22±0.12模型組1.02±0.221)1.21±0.531)0.81±0.241)飛龍掌血低劑量組0.71±0.212)0.71±0.352)0.64±0.26飛龍掌血中劑量組0.72±0.202)0.62±0.342)0.52±0.372)飛龍掌血高劑量組0.61±0.302)0.31±0.152)3)0.41±0.152)3)秋水仙堿組0.42±0.112)0.24±0.132)3)0.37±0.182)3)F/P值19.826/0.00015.469/0.0007.943/0.000

3 討 論

痛風(fēng)以高尿酸血癥為特點，發(fā)作突然，引起急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，疼痛難忍而就醫(yī)治療，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量〔6，7〕。痛風(fēng)急性發(fā)作期治療主要在于減輕及改善患者的腫脹和疼痛癥狀，西醫(yī)主要采用糖皮質(zhì)激素或秋水仙堿等藥物治療，雖然能有效地緩解疼痛癥狀，但對肝、腎及胃腸均有感染而引起不良反應(yīng)，其中秋水仙堿存在明顯的腎臟及骨髓毒性，對反復(fù)發(fā)作的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎或伴有腎功能不全的患者限制使用。

我國苗族應(yīng)用飛龍掌血在治療風(fēng)濕痹痛均有一定療效。本課題顯示，飛龍掌血能夠改善AGA大鼠步態(tài)評分及足趾腫脹體積，可見飛龍掌血可用于治療AGA作用與飛龍掌血的有效成分密切相關(guān)〔8～12〕。飛龍掌血生物總堿、水提液和醇提液均具有明顯的抗炎作用，飛龍掌血的水、醇提取物均能緩解醋酸所致小鼠疼痛，且鎮(zhèn)痛作用相當(dāng)或超過鹽酸哌替啶，原因在于飛龍掌血的水和醇提物可增加腦的β-內(nèi)啡肽蛋白表達(dá)實現(xiàn)的，β-EP是體內(nèi)產(chǎn)生的一類具有類似嗎啡作用的內(nèi)源性肽類物質(zhì)。

NF-κB信號是人體免疫系統(tǒng)抵抗微生物病原體的重要機(jī)制，TNF受體相關(guān)因子6可參與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，形成受體連接蛋白復(fù)合物并激活NF-κB誘導(dǎo)激酶，暴露NF-κB的核定位信號，進(jìn)而上調(diào)炎癥因子表達(dá)，如IL-1β。上調(diào)的IL-1β可迅速活化血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞黏附分子，誘導(dǎo)粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，刺激單核-巨噬細(xì)胞加快合成IL-6與TNF-α。IL-1β作為炎癥趨化因子和激活因子，存在于關(guān)節(jié)組織中最經(jīng)典的炎癥細(xì)胞，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔13〕。本課題提示AGA鼠的NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)。飛龍掌血可干預(yù)NF-κB信號通路，類似的文獻(xiàn)也有報道〔14～16〕，如飛龍掌血提取物及所含的呋喃型香豆素、異戊烯基的簡單香豆素、苯并菲唆類生物堿和呋喃喹啉類生物堿均可顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子IL-6和TNF-α水平，飛龍掌血提取物可抑制關(guān)節(jié)炎各種細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞對炎性介質(zhì)的釋放并抑制與炎癥相關(guān)酶的活性和表達(dá)，參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫細(xì)胞的增殖及活化。

綜上，苗藥飛龍掌血具有治療AGA的作用，與降低外周血IL-1β、IL-6和TNF-α及關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA及 NF-κBp65有關(guān)，這些藥理機(jī)制與飛龍掌血的化學(xué)成分有關(guān)。