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摘要：為了提升水生動物醫(yī)學專業(yè)實驗課的質量，在《水生動物病原微生物學實驗》中進行改革探索，設計了“嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽及病原菌的分離、鑒定綜合性大實驗”的案例，鞏固了學生對“科赫法則”的理解和運用。該實驗項目極大地提高了學生的動手能力和實驗興趣，取得了良好的教學效果。

關鍵詞：水生動物病原微生物學實驗；科赫法則；綜合性實驗；實驗改革

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2018）21-0271-02

一、引言

“水生動物醫(yī)學”（090604TK）是2013年被教育部首次批準于上海海洋大學的水產學大類下設置的新本科專業(yè)，為國內首個水生動物疾病防控領域的本科專業(yè)?！端鷦游锊≡⑸飳W實驗》是針對“水生動物醫(yī)學”新專業(yè)開設的專業(yè)必修課程之一，其理論課是《水生動物病原微生物學》。為了滿足市場對水生動物醫(yī)學專業(yè)人才極其匱乏的需求，《水生動物病原微生物學實驗》承載著該專業(yè)重要的專業(yè)技能訓練使命[1]。該課程從無到中有，經歷了逐步完善的過程，為了提升該專業(yè)綜合性大實驗的比例，提高學生的綜合性大實驗的技能，我們設計了“嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽及病原菌的分離、鑒定”綜合性大實驗的案例。歷經4年的實施與改革，取得了很好的實驗效果，對進一步深化教學改革具有重要借鑒意義。

二、實驗設計的理念

參考《致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法GB/T 18652-2002》（2002-02-19發(fā)布2002-05-01實施，中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布）的標準，在《水生動物病原微生物學實驗》專業(yè)微生物學實驗環(huán)節(jié)，針對病原菌部分的教學重點，根據“科赫法則”設立了“嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽及病原菌的分離、鑒定綜合性大實驗”，旨在建立病原菌的感染模型，鍛煉學生分離、鑒定以及保藏病原菌的綜合能力。訓練學生靈活運用理論知識的能力，融合前面單獨實驗項目中的操作技巧，綜合運用到本實驗項目中，進一步鍛煉學生的團結協(xié)作能力。

三、實驗目的和要求

通過致病性嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽，了解細菌的培養(yǎng)及人工感染方法；觀察嗜水氣單胞菌感染魚體后所造成的疾病癥狀，包括體表以及體內的病理變化特征；掌握病原菌的體外及體內分離、培養(yǎng)方法，掌握細菌傳統(tǒng)鑒定及16S rRNA分子鑒定方法，理解科赫法則，訓練病原菌保藏的技術。以4-5人為一組，分6個學時進行。

四、實驗內容和方法

1.實驗器材：培養(yǎng)皿、干燥箱、滅菌鍋；塑料水族箱（90L）、加熱棒、充氣泵、解剖刀、解剖盤、剪刀、鑷子、酒精燈、接種環(huán)、酒精棉、1mL無菌注射器、試管、火柴、一次性手套、橡膠手套、口罩；營養(yǎng)瓊脂、無菌脫纖維羊血、血瓊脂基礎培養(yǎng)基、RS瓊脂、無菌生理鹽水、MS-222麻醉劑。

2.實驗菌株：實驗室保藏致病性嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilia，Ah），菌株編號Ah-js16。

3.實驗原理：本綜合性試驗項目設計的原理依據科赫法則（Koch postulates），又稱證病律。

4.實驗操作步驟：（1）實驗準備：包括實驗魚的馴養(yǎng)和實驗菌株的活化和擴大培養(yǎng)。（2）人工感染：實驗魚人工感染方法包括浸泡、創(chuàng)傷感染、肌肉注射以及腹腔注射，本實驗采用腹腔注射，感染快速、效果較好。感染后，觀察并記錄發(fā)病情況。（3）病原菌的分離、培養(yǎng)：分別觀察記錄人工感染后4 h、8 h、16 h、24 h魚體癥狀，之后進行病魚的解剖及病原菌的平板劃線分離。（4）病原菌鑒定：細菌的鑒定方法主要包括傳統(tǒng)鑒定和現(xiàn)代分類鑒定兩種方法。本實驗采用的傳統(tǒng)鑒定方法包括：生長特性、菌落特征、革蘭氏染色、運動性、氧化酶、吲哚試驗、糖發(fā)酵實驗、細菌的致病性檢查共8個項目。細菌的現(xiàn)代分類鑒定采用16S rRNA序列測定，操作簡單（菌液直接送公司進行測序），節(jié)省時間，花費低廉（30-50元/菌株）。根據測序結果構建系統(tǒng)進化樹，登陸NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），再次確認其分類地位。（5）實驗魚及菌株處理：實驗解剖后的感染魚及分離菌株應進行無害化處理，先經121℃滅菌15min后，再進行后續(xù)處理。（6）病原菌的保藏：將分離鑒定后的病原菌株，進行液體擴大培養(yǎng)，之后按照甘油：菌懸液=3∶7的比例，進行混合，之后分裝1-2ml菌種凍存管，9管/株，分別置于-20℃，-70℃，-196℃（每個溫度各3管）進行保存、備用。

五、實驗考核方法

綜合學生之間互動的積極性、實驗小組的團隊協(xié)作精神、實驗報告中體現(xiàn)出來的應用所學知識分析和解釋實驗結果的能力給出該組的成績，分為優(yōu)、良、中、及格、不及格五級。

六、學生對實驗的評價與反饋

通過該綜合性大實驗，學生牢固強化了微生物學的基本操作技巧，對于無菌操作能夠貫穿實驗的全過程，對于“病原微生物”的理解更加透徹，對于“科赫法則”十分清楚。下面僅舉2例，展示學生的實際收獲及實驗效果。

例1：“本次實驗相對比較成功，組內同學彼此配合默契，分工明確，通過此次實驗有利于培養(yǎng)對病原微生物學的興趣，對同學們的獨立思考能力是一個非常好的鍛煉機會。”

例2：“這學期的水生動物病原微生物實驗已經結束，這是我們第一次接觸到微生物的真實世界，開始實驗之前我以為這個實驗不會很難，但是通過本實驗的逐步完成發(fā)現(xiàn)這個課程很有技術含量。不僅需要理論知識作為鋪墊，還需要有嚴謹?shù)膶嶒灳?。通過這次實驗操作，我們學到了很多，非常有收獲?！?/p>

七、總結和提高

該綜合性大實驗，確立了以學生為中心的互動實驗教學模式[2]，明顯提高了實驗教學的質量和學生的綜合素質，提升了教學團隊的整體實力。學生的實驗報告圖文并茂，很多照片也成為科學出版社的待出版教材《水生動物病原微生物學實驗》的素材，因此，對同行有一定的參考和幫助。今后如何面對高等教育現(xiàn)代化對課程內涵不斷提升的需求，培養(yǎng)具有國際競爭力的人才，仍需要更多的思考和實踐。希望此實驗案例能夠拋磚引玉，與同道共勉。

參考文獻：

[1]張慶華，宋增福，郭婧，等.“水生動物病原微生物學”實驗的教學與實踐[J].實驗科學與技術，2016，14（6）：130-133，245.

[2]梅蕓，楊華山.以學生為中心的互動實驗教學模式探索[J].實驗科學與技術，2014，12（2）：111-113.