王利君，王武亮，袁博，王晨陽

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州450014

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率在中國(guó)均呈上升趨勢(shì)，其發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)多階段、多基因的過程，研究宮頸癌的發(fā)病原因及機(jī)制對(duì)其診斷和治療具有重要意義[1]。微RNA（miRNA）是一類由19～25個(gè)核苷酸組成的小分子非編碼RNA，已有大量研究顯示其在細(xì)胞增殖、凋亡、分化及腫瘤的發(fā)病機(jī)制中有重要的調(diào)控作用，且一些研究顯示miRNA在腫瘤、糖尿病、心血管疾病中發(fā)揮重要作用[2-3]。miRNA-143是miRNA家族中的一員，其表達(dá)具有腫瘤特異性，在肺癌、前列腺癌中低表達(dá)[4]，而在肝癌中高表達(dá)[5]。缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）在腫瘤組織中表達(dá)廣泛，HIF-1α在腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移及腫瘤血管生成等過程中發(fā)揮重要作用[6]，且通過靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到miRNA-143與HIF-1α存在靶向關(guān)系，但miRNA-143靶向HIF-1α對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制尚不清楚。本研究探討了miRNA-143與HIF-1α的靶向關(guān)系，并研究了影響宮頸癌細(xì)胞增殖及凋亡的機(jī)制，以期為宮頸癌的診斷及治療提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2015年2月至2016年6月于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院存檔的50例宮頸癌患者的宮頸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。50例患者中，年齡32～82歲，平均（50.4±9.2）歲。所有患者術(shù)前均未行放化療及其他治療，且有完整的臨床資料。人宮頸癌C-33A、HeLa、CaSki細(xì)胞均購自上海斯信生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清、胰酶、青霉素、鏈霉素、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國(guó)Gibco公司；Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國(guó)Abcam公司；RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；CCK8試劑盒、BCA試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國(guó)西盟公司；酶標(biāo)儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌C-33A、HeLa、CaSki細(xì)胞，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和 100 U/ml青霉素的混合液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 不同組織及細(xì)胞中miRNA-143表達(dá)水平的檢測(cè)

采用RNA提取試劑盒提取宮頸癌組織、癌旁組織及不同宮頸癌細(xì)胞中的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)目的基因miRNA-143及內(nèi)參基因U6的引物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)miRNA-143的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，參考Invitrogen公司的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法分別將miRNA-143 mimics、miRNA-143 inhibitor及HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中（3個(gè)實(shí)驗(yàn)組），未轉(zhuǎn)染的作為對(duì)照組，調(diào)整各組細(xì)胞濃度為5×104/ml，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后室溫放置20 min，6 h后換成RPMI1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。Western blot檢測(cè)miRNA-143 mimics組、miRNA-143 inhibitor組和對(duì)照組細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 熒光素酶活性檢測(cè)

miRBase（http://mirbase.org/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、PicTa（http://pictar.mdc-berlin.de/）三大靶基因預(yù)測(cè)庫預(yù)測(cè)到miRNA-143與HIF-1α的3′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證miRNA-143與HIF-1α是否存在靶向關(guān)系，構(gòu)建野生型HIF-1α（Wt-HIF-1α）和突變型HIF-1α（Mut-HIF-1α）的3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體，并進(jìn)行miRNA-NC+miRNA-143 mimics、Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics、Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics三組共轉(zhuǎn)染，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒的說明檢測(cè)各組細(xì)胞中雙熒光素酶的活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)照組、miRNA-143 mimics組及 HIF-1α-siRNA組細(xì)胞。采用0.25%的胰蛋白酶消化上述3組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×103/ml，取 200 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，48 h后，每孔加入CCK8溶液10 μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄各組的吸光度A，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A值/對(duì)照組細(xì)胞A值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。對(duì)照組、miRNA-143 mimics組、HIF-1α-siRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)80%左右時(shí)收集細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，離心，棄上清，取1×106個(gè)細(xì)胞加入100 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，取懸浮液再加入PI和Annexin V-FITC各5 μl，充分混勻后室溫避光靜置20 min，再加入400 μl結(jié)合緩沖液，上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Ki-67、cleaved caspase 3、 β-catenin、cyclin D 1蛋白表達(dá)檢測(cè)

收集培養(yǎng)48 h的對(duì)照組、miRNA-143 mimics組、HIF-1α-siRNA組細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白，采用BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，配置12%的分離膠及5%的濃縮膠，將蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶1的比例混勻，取變性蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離后4℃轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜上，采用50 g/L的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1、GAPDH，1∶500稀釋），4℃孵育過夜，然后加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1∶1000稀釋），ECL發(fā)光劑顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析 Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-143在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，宮頸癌組織中miRNA-143的表達(dá)水平為（0.892±0.107），明顯低于癌旁組織的（6.248±0.735），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=60.29，P＜0.01）。人宮頸癌CaSki細(xì)胞中的miRNA-143表達(dá)水平高于人宮頸癌HeLa細(xì)胞和C-33A細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 不同宮頸癌細(xì)胞中miRNA-143表達(dá)水平的比較（±s）

表1 不同宮頸癌細(xì)胞中miRNA-143表達(dá)水平的比較（±s）

注：*與CaSki細(xì)胞比較，P＜0.05

2.2 不同組別HIF- 1 α蛋白表達(dá)水平的比較

miRNA-143 mimics組的HIF-1α蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，miRNA-143 inhibitor組的HIF-1α蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表 2）

表2 不同組別HIF- 1 α蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表2 不同組別HIF- 1 α蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

2.3 不同組別熒光素酶活性的比較

Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics組的熒光素酶活性低于miRNA-NC+miRNA-143 mimics組和Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics組與miRNA-NC+miRNA-143 mimics組的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同組別熒光素酶活性的比較（±s）

注：*與Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics組比較，P＜0.05

2.4 不同組別HeLa細(xì)胞存活率的比較

miRNA-143 mimics組和HIF-1α-siRNA組的細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表 4）

表4 不同組別HeLa細(xì)胞存活率的比較（%±s）

表4 不同組別HeLa細(xì)胞存活率的比較（%±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

2.5 不同組別HeLa細(xì)胞凋亡率的比較

miRNA-143 mimics組和HIF-1α-siRNA組的細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、表5）

2.6 不同組別Ki-67、cleaved caspase 3、 βcatenin、cyclin D 1蛋白表達(dá)水平的比較

miRNA-143 mimics組和 HIF-1α-siRNA組的Ki-67、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2、表6）

3 討論

近些年，miRNA作為重要的基因調(diào)控分子，與腫瘤的關(guān)系已成為生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。作為調(diào)控基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的重要部分，miRNA可參與調(diào)控多條信號(hào)通路[7]。研究顯示，miRNA參與細(xì)胞增殖、凋亡、早期發(fā)育、脂肪代謝等一系列生命活動(dòng)的各個(gè)進(jìn)程，在胃癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)異常表達(dá)，發(fā)揮原癌基因或抑癌基因的作用，其表達(dá)上調(diào)可通過下調(diào)抑癌基因而發(fā)揮癌基因的作用，表達(dá)下調(diào)可通過上調(diào)原癌基因而發(fā)揮抑癌基因的作用[8-9]。miRNA-143的生物學(xué)功能十分廣泛，參與牙齒發(fā)育、卵泡發(fā)育、脂肪代謝等生命活動(dòng)的各個(gè)進(jìn)程，在不同腫瘤中的表達(dá)可能不同，在乳腺癌、胃癌、直腸癌中表達(dá)下調(diào)，在肝癌中表達(dá)上調(diào)[10-12]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-143在宮頸癌組織中低表達(dá)，說明miRNA-143低表達(dá)影響了宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展。

圖1 過表達(dá)miRNA-143和干擾HIF- 1α 對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

表5 不同組別HeLa細(xì)胞凋亡率的比較（%±s）

表5 不同組別HeLa細(xì)胞凋亡率的比較（%±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

miRNA調(diào)控疾病的機(jī)制可能與其調(diào)控的靶基因有關(guān)，靶基因預(yù)測(cè)軟件顯示HIF-1α是miRNA-143的一個(gè)靶基因。HIF-1α是近些年發(fā)現(xiàn)的在人體缺氧條件下存在的一種轉(zhuǎn)錄因子，在卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，影響腫瘤的生長(zhǎng)、凋亡、侵襲等過程[13-14]。有研究顯示，miRNA-143可靶向HIF-1α，抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[15]。為證實(shí)miRNA-143靶向HIF-1α對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，本研究首先證實(shí)HIF-1α是miRNA-143的靶基因，細(xì)胞增殖及凋亡結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-143及抑制HIF-1α的表達(dá)均可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

圖2 過表達(dá)miRNA-143和干擾HIF- 1α 對(duì)Ki-67、cleaved caspase 3、β -catenin、cyclin D 1蛋白表達(dá)的影響

表6 不同組別Ki-67、cleavedcas pase 3、β -catenin、cyclin D 1蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表6 不同組別Ki-67、cleavedcas pase 3、β -catenin、cyclin D 1蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

細(xì)胞增殖及凋亡平衡是維持機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育所必須的，Ki-67和caspase 3是與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵基因。Ki-67位于人染色體10q25，是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，在腫瘤增殖各時(shí)期均有表達(dá)，參與多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)展及侵襲等過程，目前已作為檢測(cè)腫瘤的標(biāo)志物[16]。caspase 3是Caspase家族的關(guān)鍵蛋白，位于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，在受到凋亡信號(hào)刺激后被激活，激活后的caspase 3參與胃癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡[17-18]。Wnt信號(hào)通路是一條在進(jìn)化上相對(duì)保守的信號(hào)途徑，參與細(xì)胞增殖、分化、個(gè)體發(fā)育、凋亡等過程，Wnt/β-catenin是一條經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，與腫瘤發(fā)生、衰老和退化、骨質(zhì)疏松等疾病有關(guān)，其激活可導(dǎo)致宮頸癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生，也有研究顯示阻斷該信號(hào)通路可抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[19-21]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-143的表達(dá)及抑制HIF-1α的表達(dá)后，可使Ki-67、β-catenin、cyclin D1蛋白的表達(dá)水平降低，cleaved caspase 3蛋白的表達(dá)水平升高。

綜上所述，miRNA-143可通過靶向HIF-1α抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可為宮頸癌的診斷及治療提供新的策略及靶點(diǎn)。