張燁，惠周光，張文，馮林，張開泰，鄧壘，王文卿，周宗玫，王綠化#

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院1放療科，2特需醫(yī)療部，3免疫學(xué)研究室，4分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京100021

肺癌是目前病死率最高的常見惡性腫瘤，其中小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的惡性程度高，占所有肺癌的10%～15%[1]。Govindan等[2]報道，廣泛期SCLC占SCLC的60%～70%，患者的中位生存期僅為12個月左右?；熓菑V泛期SCLC患者的首選治療方案，多個研究提示化療有效后行胸部放療可以明顯改善預(yù)后[3-5]，但該方案僅對部分患者有效[6]。而傳統(tǒng)的影像技術(shù)，如計算機(jī)斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）難以早期判斷放化療的療效以及提示預(yù)后。因此，發(fā)現(xiàn)早期預(yù)測放化療后療效的分子標(biāo)志物，指導(dǎo)廣泛期SCLC的個體化治療，是目前臨床亟待解決的問題。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是指在患者循環(huán)系統(tǒng)中存活并且能夠被檢測到的腫瘤細(xì)胞[7]。自1869年CTC在腫瘤患者中被首次發(fā)現(xiàn)以來，已有研究顯示CTC可以預(yù)測腫瘤患者的療效并提示預(yù)后[8]。然而，CTC在SCLC中的研究主要集中在化療前后的CTC數(shù)目與SCLC的療效及化療敏感性的關(guān)聯(lián)性上[9-18]。有關(guān)CTC在化療有效患者接受胸部放療后療效預(yù)測和預(yù)后評價中的作用尚未有報道。而且，既往報道中采用檢測CTC的CellSearch技術(shù)僅能檢測上皮樣細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）陽性的CTC，對于EpCAM陰性的CTC無法檢測。本研究組前期采用具有自主知識產(chǎn)權(quán)的oHSV1-hTERT-GFP技術(shù)檢測CTC，該技術(shù)具有靈敏度高、操作簡單、可分離觀察CTC形態(tài)等優(yōu)點。因此，本研究擬采用該技術(shù)檢測化療后有效的廣泛期SCLC患者接受胸部放療前后的CTC數(shù)目，初步探討CTC與胸部放療后患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年11月至2015年7月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院接受胸部放療的廣泛期SCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為SCLC；②經(jīng)頸胸腹CT、腦MRI、骨掃描等全面檢查，根據(jù)美國退伍軍人醫(yī)院的SCLC分期為廣泛期；③KPS評分＞70分，年齡＞18歲；④初治SCLC患者，行全身化療方案評價有效；⑤愿意接受胸部放療；⑥對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)或轉(zhuǎn)移SCLC患者；②合并第二原發(fā)腫瘤者；③胸部放療未實施或者治療未完成；④隨訪資料不完整。

1.2 治療方案以及療效評價

所有患者均接受4個周期以上的全身化療，化療方案為以順鉑為基礎(chǔ)的一線方案，化療中予以止吐、水化等對癥支持處理。每2個周期化療后，均對患者進(jìn)行化療療效評價，包括頸胸腹CT和腦MRI。根據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評價，有效定義為完全緩解（CR）和部分緩解（PR）。疾病進(jìn)展定義為患者出現(xiàn)局部區(qū)域或者遠(yuǎn)處進(jìn)展、死亡或者失訪。所有治療有效的患者均接受胸部放療，放療靶區(qū)大體腫瘤體積包括殘留的肺部原發(fā)病灶以及殘留的縱隔和鎖骨上腫大淋巴結(jié)。臨床腫瘤體積（clinical tumor volume，CTV）為原發(fā)病灶外放8 mm，以及化療前受累的縱隔和鎖骨上淋巴引流區(qū)，CTV外放5 mm為計劃靶區(qū)體積（planning target volume，PTV）。處方劑量為95%PTV 60 Gy，每次2 Gy，共30次，或45 Gy，每次3 Gy，共15次。所有放療計劃均采用調(diào)強(qiáng)放射治療技術(shù)。胸部放療后休息1個月評價有效的患者在排除腦轉(zhuǎn)移后予以腦預(yù)防照射，照射靶區(qū)為全腦，處方劑量為25 Gy，每次2.5 Gy，共10次，照射技術(shù)為二維兩野對穿照射。所有患者治療結(jié)束后均定期隨訪，第1～2年每3個月復(fù)查1次，第3～5年每6個月復(fù)查1次，隨訪日期截至2018年1月，隨訪內(nèi)容包括頸胸腹CT和腦MRI。生化檢驗結(jié)果顯示堿性磷酸酶升高，或全身有明顯的疼痛、固定壓痛點時，行骨掃描檢查?？偵鏁r間（overall survival，OS）定義為從病理診斷開始日期到患者死亡、失訪日期或者末次隨訪日期。

1.3 CTC檢測

所有入組患者在胸部放療前、后共2個時間點，分別抽取空腹靜脈血4 ml至EDTA抗凝采血管（購自美國BD公司）中，并于標(biāo)本離體后1 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實驗室用于CTC檢測。重要實驗步驟如下[19-20]：①抗凝血經(jīng)紅細(xì)胞裂解液（購自美國Qiagen公司）裂解紅細(xì)胞，分離有核細(xì)胞；2 ml RPMI 1640培養(yǎng)基（購自美國HyClone公司）重懸有核細(xì)胞，移入6孔板并標(biāo)記，每孔加入1 ml單細(xì)胞懸液（4 ml血約含有1×107個有核細(xì)胞）。取出oHSV1-hTERT-GFP病毒，將病毒加入上述加有細(xì)胞懸液的6孔板中（按照MOI=1比例感染細(xì)胞）。將6孔板放入37℃、5%CO2條件下的孵箱內(nèi)孵育1 h后取出，每孔補(bǔ)加1 ml含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放置在原孵箱內(nèi)進(jìn)行孵育。轉(zhuǎn)染病毒20～24 h后收集細(xì)胞（病毒pfu約為1.3×108，因此每孔加入病毒50 μl）。②收集細(xì)胞，并用CD45單克隆抗體（HI30）-PECy5（購自美國BD公司）標(biāo)記白細(xì)胞，陰選血液中的CTC：向上述細(xì)胞中加入400 μl磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），100 μl CD45抗體（100 μl反應(yīng)體系中20 μl CD45抗體與 1×106個細(xì)胞充分反應(yīng)，每支離心管中約5×106個細(xì)胞），室溫下避光孵育30 min。孵育30 min后每支離心管中加入2 ml PBS洗滌，500×g離心5 min后棄掉PBS。③Guava系列流式細(xì)胞儀（購自美國Millipore公司）檢測CTC：將上述的單細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每孔200 μl，細(xì)胞流式儀檢測結(jié)束后記錄并分析整理數(shù)據(jù)（CD45-/GFP+的細(xì)胞定義為CTC）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計數(shù)資料以率（%）表示。采用多因素線性回歸分析CTC數(shù)目與臨床特征的關(guān)系。生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，兩組生存時間的比較采用Logrank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征及治療情況

本研究共入組16例一線化療有效的廣泛期SCLC患者，其中1例患者胸部放療后出院失訪，最終15例患者納入分析。15例廣泛期SCLC患者的年齡為42～68歲，中位年齡59歲；吸煙數(shù)量0～120包/年，中位吸煙數(shù)量30包/年；化療周期4～8個，中位化療周期6個；其他臨床特征和治療情況詳見表1。

表1 15例廣泛期SCLC患者的臨床特征和治療情況

2.2 預(yù)后

至隨訪結(jié)束，共對患者進(jìn)行了6.0～42.2個月的隨訪，中位隨訪時間35.5個月，其中生存患者的隨訪時間為34.5～42.2個月，中位隨訪時間39.4個月。共9例患者治療失敗，隨訪過程中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。15例SCLC患者的OS為6.0～42.2個月，中位OS為35.5個月；無疾病進(jìn)展生存時間（progression-free survival，PFS）為4.6～42.2個月，中位PFS為29.8個月。

2.3 胸部放療前后CTC的數(shù)目

15例廣泛期SCLC患者均檢測到CTC，CTC檢出率為100%。胸部放療前基線水平的CTC中位數(shù)目為27/4 ml[（6～50）/4 ml]；胸部放療后的CTC中位數(shù)目為11/4 ml[（1～23）/4 ml]。多因素線性回歸分析顯示：胸部放療前CTC數(shù)目與廣泛期SCLC患者的年齡、性別、吸煙、TNM分期、是否單臟器轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目均無關(guān)（P＞0.05）。

2.4 胸部放療前CTC數(shù)目與廣泛期SCLC患者PFS和OS的關(guān)系

以胸部放療前基線水平的CTC中位數(shù)目27/4 ml為界，將全組患者分為CTC≥27/4 ml組（高基線組）和CTC＜27/4 ml組（低基線組）。高基線組患者共8例，其中6例患者復(fù)發(fā)。低基線組患者共7例，其中3例患者復(fù)發(fā)。高基線組的中位PFS為9.5個月，低基線組的中位PFS時間未達(dá)到，但兩組患者的中位PFS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.64，P=0.20）。高基線組4例患者死亡，低基線組2例患者死亡。高基線組的中位OS為14.2個月，低基線組的中位OS未達(dá)到，但兩組患者的中位OS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.45，P=0.22）。散點圖提示隨著胸部放療前CTC數(shù)目的增加，無疾病進(jìn)展生存及總生存時間逐漸縮短。（圖1～圖4）

圖1 胸部放療前不同基線CTC數(shù)目患者的PFS

圖2 胸部放療前CTC數(shù)目與PFS的散點圖

2.5 胸部放療后CTC數(shù)目與廣泛期SCLC患者PFS和OS的關(guān)系

以胸部放療后的CTC中位數(shù)目11/4 ml為界，將全組患者分為CTC≥11/4 ml組（高療后組）和CTC＜11/4 ml組（低療后組）。高療后組患者共6例，全部復(fù)發(fā)。其中5例患者胸部放療前CTC數(shù)目超過27/4 ml，另1例患者胸部放療前CTC數(shù)目為6/4 ml，胸部放療后上升至17/4 ml，該患者很快出現(xiàn)復(fù)發(fā)。低療后組患者共9例，3例患者復(fù)發(fā)，6例患者未復(fù)發(fā)。未復(fù)發(fā)患者中，2例患者胸部放療前CTC數(shù)目超過27/4 ml，胸部放療后下降至（2～3）/ml。3例復(fù)發(fā)患者中，1例患者胸部放療前CTC數(shù)目超過27/4 ml，3例患者的復(fù)發(fā)時間均較晚。高療后組的中位PFS為6.1個月，低療后組的中位PFS未達(dá)到，兩組患者的中位PFS比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.25，P＜0.01）。高療后組死亡5例，低療后組死亡1例。高療后組的中位OS為12.2個月，低療后組的中位OS未達(dá)到，兩組患者的中位OS比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.85，P＜0.01）。散點圖提示隨著胸部放療后CTC數(shù)目的增加，無疾病進(jìn)展生存以及總生存時間逐漸縮短。（圖5～圖8）

圖3 胸部放療前不同基線CTC數(shù)目患者的OS

圖4 胸部放療前CTC數(shù)目與OS的散點圖

圖5 胸部放療后不同CTC數(shù)目患者的PFS

圖6 胸部放療后CTC數(shù)目與PFS的散點圖

圖7 胸部放療后不同CTC數(shù)目患者的OS

圖8 胸部放療后CTC數(shù)目與OS的散點圖

3 討論

本研究首次報道了胸部放療前后CTC與廣泛期SCLC化療有效患者的療效預(yù)測和預(yù)后關(guān)系。初步研究結(jié)果顯示，接受胸部放療的一線化療有效的廣泛期SCLC患者，放療后的CTC數(shù)目與其胸部放療的療效以及預(yù)后明顯有關(guān)。低療后組患者治療失敗的例數(shù)遠(yuǎn)小于高療后組，而且低療后組患者的PFS和OS均明顯長于高療后組（P＜0.01）。胸部放療前低基線組患者復(fù)發(fā)和死亡的例數(shù)也均低于高基線組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

端粒酶在人體正常細(xì)胞中的活性往往被抑制，而在90%以上的腫瘤細(xì)胞中處于活化狀態(tài)[21]，腫瘤細(xì)胞中端粒酶的轉(zhuǎn)錄水平較高。本研究檢測方法的建立便以此為基礎(chǔ)，構(gòu)建了插入人端粒酶活性催化單位（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）啟動子和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)的單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV），將HSV病毒的復(fù)制關(guān)鍵基因ICP4的啟動子替換為hTERT啟動子，并在下游連接GFP表達(dá)盒。HSV病毒在感染腫瘤細(xì)胞后，在hTERT高表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中激活hTERT啟動子下游的GFP表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞能夠自發(fā)綠色熒光，隨后即可通過流式細(xì)胞儀直接對CTC進(jìn)行計數(shù)。該技術(shù)已用于多種惡性腫瘤的CTC檢測[19]。與Cell-Search技術(shù)相比，該技術(shù)對肺癌CTC的檢出率較高（33.3%vs 71.2%，P＜0.01），而且檢出率不受肺癌病理類型和分期的影響[22]。本研究利用該技術(shù)對廣泛期SCLC患者CTC的檢出率為100%，高于Cell-Search技術(shù)的89.5%～100%[9,11-12,14,16-18]，以及RT-PCR技術(shù)的84.4%～96.4%[10,15]，也再次證實本技術(shù)的高敏感度。近期，有研究報道采用類似的腺病毒技術(shù)（OBP-401）用于檢測CTC，檢出率為96%，然而該技術(shù)有明顯的缺陷，僅能檢測具有一定大小的GFP陽性表達(dá)的CTC[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，胸部放療前基線水平CTC數(shù)目≥27/4 ml組的患者中位PFS為9.5個月，中位OS為14.2個月，而且隨著CTC數(shù)目增加，疾病控制越差，同時患者的生存情況也越差。既往多個研究均提示，對于SCLC患者，一線化療前的基線CTC數(shù)目與腫瘤的復(fù)發(fā)和生存相關(guān)[9-11,13,15-18]。Aggarwal等[9]采用CellSearch技術(shù)檢測50例SCLC患者的CTC數(shù)目，其中廣泛期SCLC患者30例，研究發(fā)現(xiàn)基線CTC數(shù)目＜50個患者的中位PFS明顯長于CTC≥50個患者（10個月 vs 4.8個月，P＜0.01），而且兩組患者的OS比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（20.2個月 vs 11.8個月，P＜0.05）。同樣的，Cheng等[11]報道了89例廣泛期SCLC患者，治療前CTC數(shù)目＜10個患者與CTC數(shù)目≥10個患者的OS比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（16.6個月 vs 8.2個月，P＜0.01），但兩組患者的PFS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。另外，有2個研究報道采用RT-PCR技術(shù)分別檢測葉酸受體陽性和CK-19 mRNA陽性CTC也得到類似的結(jié)果[10,15]。其中Shen等[10]利用RT-PCR檢測葉酸受體陽性CTC技術(shù)檢測80例SCLC患者，其中廣泛期SCLC患者77例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一線化療前基線低水平CTC患者的中位PFS長于基線高水平CTC患者（9.1個月vs 6.9個月，P＜0.05）。與本研究采用類似病毒技術(shù)的Huang等[12]對25例廣泛期SCLC患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)基線CTC數(shù)目≥5個患者的OS短于CTC數(shù)目＜5個的患者（358 d vs 223 d），但受樣本量的限制，兩組患者的OS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究也得到同樣的結(jié)果，基線水平的CTC可能提示廣泛期SCLC患者的復(fù)發(fā)和生存。對于大部分基線水平CTC數(shù)目較高的患者，行胸部放療后很快出現(xiàn)全身進(jìn)展，這些患者是否需要加強(qiáng)全身治療而非行胸部放療，值得進(jìn)一步的研究。

本研究中胸部放療后CTC數(shù)目≥11/4 ml的患者PFS和OS均明顯短于CTC數(shù)目＜11/4 ml的患者（P＜0.01），而且CTC數(shù)目越多，復(fù)發(fā)的風(fēng)險越大，出現(xiàn)復(fù)發(fā)的時間越短。既往也有多個研究證實，對于SCLC患者，采用CellSearch和RT-PCR技術(shù)檢測一線化療后的CTC數(shù)目與腫瘤的復(fù)發(fā)和生存有關(guān)[9,11,15,17-18]。Aggarwal等[9]利用 CellSearch 檢測技術(shù)對CTC進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第2個周期化療第1天CTC數(shù)目＜5個患者的中位PFS遠(yuǎn)高于CTC數(shù)目≥5個的患者（10個月 vs 3.17個月，P＜0.01），兩組患者的OS比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（18個月vs 9個月，P＜0.01）。同樣的，Cheng等[11]報道中，第2個周期化療后的CTC數(shù)目＜10個提示預(yù)后良好，CTC數(shù)目≥10個和＜10個兩組患者的中位PFS和中位OS比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（5.6個月 vs 3.1個月，P＜0.01；12.7個月vs 6.9個月，P＜0.01）。Shi等[15]采用RT-PCR技術(shù)檢測CK-19 mRNA陽性CTC時也發(fā)現(xiàn)，1個周期化療后和3個周期化療后能檢測到CTC的患者，其PFS和OS均短于無法檢測到CTC的患者（P=0.008和P=0.002；P=0.003和P=0.001）。與本研究采用類似病毒技術(shù)的研究也發(fā)現(xiàn)，2個周期化療后PR的患者，CTC數(shù)目＜2個提示良好的PFS（8.3個月 vs 3.8個月，P=0.07），受病例數(shù)限制，兩組患者的PFS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[12]。以上研究均進(jìn)一步證實胸部放療后CTC數(shù)目可提示廣泛期SCLC的復(fù)發(fā)和生存。胸部放療后CTC數(shù)目高的患者，包括胸部放療前CTC數(shù)目低但胸部放療后CTC數(shù)目升高的患者，均很快出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對于該類患者，需要加強(qiáng)全身治療才可能改善療效。但也需要注意胸部放療前CTC數(shù)目高，而經(jīng)胸部放療后迅速下降的患者，預(yù)后和疾病控制好，值得進(jìn)一步驗證。

本研究還存在一定的不足：①全組研究病例數(shù)少，盡管廣泛期SCLC一線化療后有效率高，但化療后接受胸部放療的患者相對少，入組偏慢。②本研究中納入的廣泛期SCLC患者的中位PFS和中位OS要明顯長于既往的研究報道，可能與本研究中納入的患者高選擇性有關(guān)，如胸部放療前的腫瘤負(fù)荷小，單臟器轉(zhuǎn)移多以及轉(zhuǎn)移數(shù)目相對較少，而且均是化療后轉(zhuǎn)移病灶消失、胸部病灶明顯縮小的患者。③本研究未在患者隨訪階段監(jiān)測CTC數(shù)目，無法詳細(xì)反映腫瘤的負(fù)荷動態(tài)變化與CTC數(shù)目的關(guān)系。

綜上所述，本研究初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于一線化療有效的廣泛期SCLC患者，胸部放療后的CTC數(shù)目可以預(yù)測患者的復(fù)發(fā)以及生存，但需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證。

利益沖突和作者貢獻(xiàn)聲明

本研究所有作者均無潛在利益沖突。張燁負(fù)責(zé)研究設(shè)計、病例收集、數(shù)據(jù)分析和論文寫作；惠周光負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析和論文寫作；張文、馮林、張開泰負(fù)責(zé)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測；鄧壘、王文卿、周宗玫負(fù)責(zé)病例收集、標(biāo)本質(zhì)控和數(shù)據(jù)分析；王綠化負(fù)責(zé)研究設(shè)計、數(shù)據(jù)分析和論文寫作。