李凡玲，田虎，周明，趙艾君，王為，印愛軍，杜偉強

仙桃市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，湖北 仙桃433000

鼻咽癌起源于鼻咽部表面上皮細(xì)胞，是中國南部最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率為每年20/10萬～50/10萬[1-2]。鼻咽癌的發(fā)病部位較深且早期癥狀不典型，大部分患者確診時已為晚期。盡管鼻咽癌的放療和化療已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但是由于局部復(fù)發(fā)率或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，鼻咽癌的治療效果仍不令人滿意[3]。因此，需要尋找可以判斷鼻咽癌患者預(yù)后的新的生物學(xué)標(biāo)志物和新的治療靶點。FOXM1又稱為HFH-11、MPP2和Win，屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，主要表達(dá)于增殖期細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中，在終末分化和靜止期細(xì)胞中不表達(dá)。FOXM1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1～S期和G2～M期轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮廣泛的生物學(xué)功能，包括參與細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、DNA損傷修復(fù)、組織穩(wěn)定、血管生成、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生和耐藥等過程[4]。大量研究表明，F(xiàn)OXM1高表達(dá)于多種惡性腫瘤中，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌和胰腺癌等，與腫瘤進(jìn)展快、侵襲性高、易耐藥以及預(yù)后不良有關(guān)[5-6]。體外實驗表明，抑制FOXM1可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高化療的敏感度[7]。然而，目前關(guān)于FOXM1在鼻咽癌中的研究較少。因此，考慮到FOXM1在惡性腫瘤中的重要作用，本研究進(jìn)行了原發(fā)性鼻咽癌組織FOXM1的表達(dá)特征及其與鼻咽癌患者臨床特征之間關(guān)系的研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月至2016年1月仙桃市第一人民醫(yī)院收治的經(jīng)病理學(xué)檢查確診的鼻咽癌患者112例，選取同期于仙桃市第一人民醫(yī)院接受治療的經(jīng)病理學(xué)檢查確診的慢性鼻咽炎患者41例。所有患者均能獲取完整的病歷資料和病理活檢組織標(biāo)本；所有鼻咽癌患者均接受含或不含化療的標(biāo)準(zhǔn)全量放療，腫瘤活檢標(biāo)本均于治療前獲取。鼻咽癌患者中，男76例，女36例；平均年齡（45.1±11.1）歲。慢性鼻咽炎患者中，男27例，女14例；平均年齡（44.2±12.3）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 資料收集

收集鼻咽癌患者的性別、年齡、病理類型、美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期、T分期、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等資料。分析比較鼻咽癌組織與慢性鼻咽炎組織中FOXM1的表達(dá)情況，并對FOXM1表達(dá)與鼻咽癌患者的臨床特征及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析。通過門診定期隨訪、電話等方法對所有鼻咽癌患者進(jìn)行7～65個月的隨訪，隨訪日期截至2016年7月1日?？偵嫫冢╫verall survival，OS）為從放療開始至患者死亡或末次隨訪的時間。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用福爾馬林固定，石蠟包埋的活檢組織進(jìn)行FOXM1抗體免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片厚度為4 μm，切片常規(guī)用二甲苯脫蠟至水，再用梯度濃度酒精水化，采用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH=6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在3%的雙氧水里室溫孵育30 min。滴加5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液，室溫封閉30 min甩去多余液體，滴加兔抗人FOXM1多克隆抗體（1∶200）至組織標(biāo)本上，37℃孵育1 h；滴加生物素化山羊抗兔二抗，在37℃下孵育20 min。然后行二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間。顯微鏡下觀察組織染色變化，評估陽性程度。評估標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)[8]。每張切片隨機(jī)選取5個高倍鏡視野進(jìn)行結(jié)果判定，按染色強度評分：0分，未著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。按陽性細(xì)胞比例評分：陰性為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。根據(jù)兩項積分之和判定結(jié)果，＞3分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中FOXM 1表達(dá)情況的比較

鼻咽癌組織中FOXM1的高表達(dá)率為66.1%（74/112），明顯高于慢性鼻咽炎組織的34.1%（14/41），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.52，P＜0.01）。

2.2 FOXM 1表達(dá)情況與鼻咽癌患者臨床特征的關(guān)系

FOXM1高表達(dá)與鼻咽癌患者的AJCC分期、T分期、N分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）；FOXM1高表達(dá)與鼻咽癌患者的年齡、性別、病理類型無關(guān)（P＞0.05）。（表1）

表1 FOXM 1表達(dá)情況與鼻咽癌患者臨床特征的關(guān)系

2.3 預(yù)后情況的比較

生存分析結(jié)果顯示：FOXM1低表達(dá)鼻咽癌患者的中位生存時間未達(dá)到，F(xiàn)OXM1高表達(dá)鼻咽癌患者的中位生存時間為43.89個月（95%CI：38.45～49.33）；FOXM1低表達(dá)鼻咽癌患者的總生存率高于FOXM1高表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.09，P=0.02）。（圖1）

圖1 FOXM 1高表達(dá)與低表達(dá)鼻咽癌患者的總生存曲線

3 討論

鼻咽癌與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌在許多方面均有區(qū)別，包括與EB病毒感染有關(guān)，對放療和化療敏感等[9-10]。近期研究表明，一些自然酚類化合物可以通過磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶信號通路抑制EB病毒感染腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展[11]。盡管新的放化療聯(lián)合治療方案提高了鼻咽癌患者的長期生存率，但是由于高復(fù)發(fā)率和高遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，鼻咽癌患者的病死率仍較高。有相同臨床分期的鼻咽癌患者接受相似治療方案后預(yù)后仍差異較大，因此，尋找新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點對鼻咽癌患者的治療和預(yù)后具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中FOXM1的高表達(dá)率明顯高于慢性鼻咽炎組織（P＜0.01）。越來越多的證據(jù)表明，F(xiàn)OXM1過表達(dá)與乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌和白血病等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在實體瘤中，腫瘤基因組基因表達(dá)譜分析已經(jīng)一致地將FOXM1基因鑒定為最常上調(diào)的基因[12]。以上研究均表明，F(xiàn)OXM1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。此外，許多臨床研究也證實，高表達(dá)FOXM1的腫瘤細(xì)胞比低表達(dá)FOXM1的腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生耐藥，抑制FOXM1表達(dá)可以提高腫瘤對化療藥物的敏感度，進(jìn)一步證明了FOXM1在腫瘤細(xì)胞生存、進(jìn)展及耐藥中的作用[7]。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1高表達(dá)與鼻咽癌患者的AJCC分期、T分期、N分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），F(xiàn)OXM1高表達(dá)鼻咽癌患者的總生存率低于FOXM1低表達(dá)的患者（P＜0.05）。Jiang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1在鼻咽癌組織和C666-1細(xì)胞中過表達(dá)，且FOXM1過表達(dá)與鼻咽癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，該研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。FOXM1抑制劑——硫鏈絲菌素可以通過下調(diào)MMP-2、MMP-9、FSCN1、PXN 基因表達(dá)來抑制C666-1細(xì)胞的增殖和遷移。Huang等[14]通過免疫組織化學(xué)染色研究發(fā)現(xiàn)Aurora-B和FOXM1對于接受化療的鼻咽癌患者是不良預(yù)后的標(biāo)志。Hou等[15]通過篩選紫杉醇抵抗鼻咽癌細(xì)胞的ABC轉(zhuǎn)運體基因和FOX分子基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1和ABCC5在紫杉醇抵抗鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽癌患者腫瘤組織中均過表達(dá)。且FOXM1通過結(jié)合ABCC5基因啟動子FHK共同序列調(diào)節(jié)ABCC5基因表達(dá)。抑制FOXM1或ABCC5可以抑制紫杉醇藥物的排出，增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，過表達(dá)FOXM1與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，F(xiàn)OXM1高表達(dá)與鼻咽癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和不良預(yù)后有關(guān)。FOXM1可以作為鼻咽癌的預(yù)后分子和潛在治療靶點，為鼻咽癌患者的預(yù)后評估及臨床靶向治療提供重要參考價值。但本研究樣本量有限，故應(yīng)進(jìn)一步加大樣本量并深入研究闡明FOXM1在鼻咽癌患者中的作用機(jī)制，為鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制研究及臨床治療提供重要依據(jù)。