□ 陳 丹 付偉超 商丘市質量技術檢驗測試中心

“民以食為天，食以安為先”，隨著生活水平的不斷提升，人們對于食品的要求也比以前要嚴格得多，不僅限于以前的能夠吃飽飯，怎樣能夠吃好，吃得有營養(yǎng)成為當今生活的主方向。大家的目光逐漸關注到食品這方面。隨著我國食品生產(chǎn)，加工過程和流通過程的快速發(fā)展，導致不少黑心商販開始投機取巧，毒豆芽、紅心鴨蛋、“大頭娃娃事件”、皮革酸奶等等漸漸出現(xiàn)在大家的生活中。食品安全問題成為大家關注的重大問題。

隨著食品發(fā)展速度的加快，不僅僅國內(nèi)食品的流通，不少進口食品深受當今國民的喜愛，很多人開始喜歡海外代購。由于微生物中的致病性細菌可以導致的疾病不斷增加，而且食品中的致病性細菌會危害人們的健康，在國外公布的那些微生物污染食品和人類健康的事件在我國依然存在。

食品是否發(fā)霉變質直接影響到消費者的身體健康，故食品中菌落總數(shù)、霉菌、致病菌的測定是評判產(chǎn)品質量是否合格、是否對人類的健康產(chǎn)生危害的重要指標。本文對食品中經(jīng)常檢測的幾項微生物指標的檢測方法進行探討。

1 食品中菌落總數(shù)的常規(guī)檢測方法

菌落總數(shù)的檢測是食品微生物檢測中最常規(guī)的檢測。食品中菌落總數(shù)的多少直接影響食品的貨架期，控制好菌落總數(shù)的數(shù)值在食品品質方面有著重要的作用。當今，菌落總數(shù)的檢測方法常規(guī)有兩種，一種是參照GB4789.2-2016的國家標準檢測方法，另一種是紙片快速檢測方法。

1.1 菌落總數(shù)的定義

菌落總數(shù)是指食品檢驗樣品按照國家標準的處理辦法，在一定溫度下，使用一定的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定的時間后，所得每克樣品或者是每毫升樣品中生長出來的微生物的總稱。該項目主要作為判定食品被細菌污染程度的標記，也可應用菌落總數(shù)的檢驗方法來反映食品在生長儲存的狀態(tài)中微生物繁殖的情況、生長的動態(tài)。以反映食品在生產(chǎn)、加工、銷售過程中是否符合衛(wèi)生要求，為被檢驗樣品是否合格，人們是否可以使用提供一定的參考。

1.2 實驗的關鍵因素：無菌意識

在進行食品微生物的各項檢測過程中，實驗者必須明確一個非常關鍵的因素——無菌意識。整個實驗過程中檢測使用的所有東西都必須是無菌的、經(jīng)過殺毒滅菌的。實驗環(huán)境所謂的無菌，是指在環(huán)境中一切有生命活動的微生物的細胞及其孢子或芽胞都不存在。對實驗人員來說，實驗用的實驗服、帽子、口罩、全部都是殺過菌的，實驗人員的手部要進行消毒。實驗使用的所有材料和物品包括培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀、培養(yǎng)基等都是經(jīng)過高壓滅菌后的。無菌意識在整個過程都要嚴格遵守。

圖1 菌落總數(shù)操作過程

1.3 實驗操作過程

微生物的實驗過程，按照GB4789.2-2016的操作過程進行操作。按圖1中的過程進行操作。對待做樣品要進行連續(xù)倍數(shù)的樣品稀釋。制備10倍系列稀釋的樣品勻液時，每一步都應該搖勻試管或反復吹吸，實驗過程中可以使用滅菌后的移液管或者可以滅菌的槍頭的移液器，使待測樣品中的菌體能夠充分分散均勻。

對于一些酸度較高的樣品，例如食醋，需要按標準GB/T 4789.22-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 調味品檢驗》中的要求先用滅菌的20%～30%碳酸鈉溶液將其pH值調至中性后才可以準確檢測出菌落總數(shù)。不然食品的酸度太高將影響實驗的結果，最終的結果有可能直接是0。 pH值的大小一定會影響食品中菌落總數(shù)的測定結果，只有做實驗時將pH值調至中性，才能準確測定出食品中的菌落總數(shù)。通過不少實驗證明，pH值在3.8～7.0時，對菌落總數(shù)檢驗的結果會影響小一些，隨著pH值的減小，菌落總數(shù)就會越來越小。當所檢測的pH值結果在2.1前后時，可以對瓊脂上的菌落總數(shù)起到完全抑制作用。因此，大家在實驗中一定要仔細認真，考慮pH值對檢驗結果的影響，做實驗時一定要先調節(jié)pH值至中性后，才能檢驗出菌落總數(shù)的真實結果。

1.4 樣品從稀釋到傾注平板的時間要求

在一般的實驗室中，由于每次進行檢驗的樣品數(shù)量比較多，實驗室工作人員為了可以保證工作效率，保證操作的連續(xù)和方便性，實驗人員一般都是先將所有待檢樣品稀釋好后，再依次傾注平板，如此操作就導致一個樣品由開始稀釋到傾注平板的總時間通常要一個小時以上。經(jīng)過多次實驗發(fā)現(xiàn)，實驗的樣品樣從稀釋到傾注平板的時間間隔越長，測出來的結果會越多。菌落總數(shù)的生長速度跟時間呈正比增長的關系，短短的十幾分鐘對于呈對數(shù)生長的細菌來說有可能已經(jīng)生了很多代。因此，樣品從處理稀釋樣品開始到傾注平板的時間最好不要超過20 min。

1.5 培養(yǎng)基溫度要求

樣品稀釋后，做出合理的稀釋倍數(shù)后，接著進行倒平板。倒平板所用的培養(yǎng)基都是滅菌后冷卻至46 ℃左右的培養(yǎng)基。倒平板所使用的培養(yǎng)基溫度過高可能會殺滅部分不耐熱的細菌，也會使冷凝水過多，滴落在培養(yǎng)基表面，使生長在平板底部的細菌蔓延生長，影響菌落總數(shù)的計數(shù)。培養(yǎng)基的溫度太低時，瓊脂容易凝固，使得培養(yǎng)基無法與稀釋液充分混勻，菌落無法均勻生長，也會影響菌落計數(shù)。倒好培養(yǎng)基后，沿一個方向進行搖晃直到稀釋樣品與培養(yǎng)基混合均勻。將平板倒置存放于36 ℃的培養(yǎng)箱中48 h。

2 食品中霉菌計數(shù)的常規(guī)檢測方法

霉菌是絲狀真菌的通稱。霉菌廣泛存在于自然界中，因為霉菌會形成各種各樣微小的孢子，孢子通過各種傳播途徑很容易污染食品。當溫度和濕度適合霉菌生長時，會非常迅速地形成分枝繁茂的菌絲體，但又不像蘑菇那樣產(chǎn)生大型的子實體。在潮濕溫暖的地方，很多物品上長出一些肉眼可見的絨毛狀、絮狀或蛛網(wǎng)狀的菌落，那就是霉菌。溫度對霉菌的繁殖及產(chǎn)毒均有重要的影響，不同種類的霉菌其最適溫度是不一樣的，很多霉菌繁殖最適宜的溫度為24～30 ℃。由于霉菌的生長繁殖周期短，生長極為迅速，非常容易造成食品的發(fā)霉腐爛，最后變質。發(fā)霉的花生、發(fā)霉的玉米和小麥中的黃曲霉毒素非常高，人類誤食了發(fā)霉的食品會引起身體的癌變。自從20世紀六七十年代發(fā)現(xiàn)強致癌的黃曲霉毒素以來，霉菌與霉菌毒素對食品的污染引起了人們的重視。我國制定了 GB2761-2017《食品中真菌毒素限量》標準 、GB4789.15-2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》，各個食品檢測機構都全面開展霉菌的檢測工作。

2.1 霉菌的培養(yǎng)方式

有關霉菌的檢驗方法跟前面所述的菌落總數(shù)的檢測方法的注意事項相似。2017年4月19日，有關霉菌檢測的國家標準改變了，GB4789.15-2016跟GB 4789.15-2010的最大改變就是5.2中的培養(yǎng)中平板的培養(yǎng)方式。2010版的標準中霉菌平板的是待瓊脂凝固后，將平板倒置，（28±1）℃培養(yǎng)5 d，觀察并記錄；2016版的標準中霉菌平板的是待瓊脂凝固后，正置平板，（28±1）℃培養(yǎng)5 d，觀察并記錄。通過半年來的實驗證明，倒置平板的培養(yǎng)方式出來的結果比較準確。正置平板培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)箱中的溫度不斷升高，致使底部的培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)，遇到培養(yǎng)皿的上部，水分會匯集在一起,集聚到一定的大小時，會滴落到下層的培養(yǎng)基上，造成下部霉菌數(shù)的不準確。另有些霉菌會長孢子，早期生長出的霉菌孢子就會在培養(yǎng)基內(nèi)擴散，形成新的菌落，導致結果不準確。所以，筆者認為霉菌的培養(yǎng)方式還是應該采用倒置培養(yǎng)，這樣結果更接近于產(chǎn)品的自身結果。

2.2 解決霉菌偏差的方法

對于每次實驗中結果的偏差，實驗室可以讓不同的實驗人員按照國家標準的規(guī)定進行實驗，實驗樣品應選取均勻且霉菌數(shù)均可以通過實驗測得的測試樣品。對于同一個樣品，實驗人員應該做多次的平行實驗，來確定最終的霉菌數(shù)量。

2.3 實驗注意事項

按照國家標準的檢測方法霉菌檢測時間長，所以在實驗過程中實驗人員有必要進行多次觀察。實驗人員應該在實驗前做好實驗計劃，確定觀察記錄的時間。一般情況下在培養(yǎng) 24 h后就應該進行觀察，對于那些生長迅速的，菌絲很長的一類霉菌 48 h 后就可計數(shù)。 在實驗過程中實驗人員可以在操作工作臺上放置兩個倒好培養(yǎng)基的，待接種結束后，與同批次進行的霉菌進行一起培養(yǎng)，來對整個實驗過程進行驗證，可以發(fā)現(xiàn)在整個實驗過程中是否受環(huán)境污染。檢驗前后都應認真做好全面的消毒滅菌工作。霉菌計數(shù)結束后應第一時間將有霉菌的培養(yǎng)物高壓滅菌,以防進一步污染。

3 結語

微生物檢測的誤差除了培養(yǎng)基和檢測環(huán)境之外，還來自于實驗樣品和檢驗的操作過程和實驗的準備環(huán)節(jié)。通常情況下食品微生物樣品的檢測不能復檢。但如果當菌落總數(shù)在此樣品所執(zhí)行標準的臨界值或者菌落結果出現(xiàn)明顯的異常時，也是有必要進行復檢的。可以重新檢測儲存條件跟之前相符的同一生產(chǎn)批次的樣品。食品微生物檢測的準確性，必須貫穿在整個實驗過程。只有嚴格控制，才能控制好食品的安全性，才能保證國民的安全！