蔣 琴,龍文聰,2,劉安萱,2,肖析蒙,2,劉遠志，李晨昊，楊瑤君

(1.樂山師范學院 竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室，四川 樂山 614000；2.西華大學 食品與生物工程學院， 四川 成都 610039)

四川是竹子的主要產地[1]。不同海拔區(qū)域分布不同竹品種，不同竹種其形態(tài)學特征、生理生化特征及地上生物量等對海拔響應是非線性的[2-3]。海拔垂直變化地帶是研究植物對氣候變化響應的理想區(qū)域[4]。峨眉山具有典型的垂直氣候特征[5]，是研究竹葉特征受海拔影響較合適的地區(qū)。葉片改變形態(tài)及結構來響應環(huán)境變化，其結構特征最能反映環(huán)境因子與植物的共同進化[2]。比葉面積是單位葉面積與質量的比值，也是研究植物葉片重要的性狀之一[6-7]。有關于海拔對草本及木本植物葉片形態(tài)和解剖結構影響報道較多[3,8-17]，關于海拔梯度上竹類葉片形態(tài)、結構變化的研究報道尚不多見。姜永雷等[8]研究了不同海拔川滇高山櫟葉片的解剖結構特征；李蟠等[9]研究不同海拔貢嘎山冷杉比葉面積和非結構性碳水化合物含量變化的研究表明，隨海拔升高，比葉面積減??；何濤等[10-11]綜合分析了青藏高原高山植物的形態(tài)和解剖結構及其對環(huán)境的適應性研究進展，比較了不同海拔火絨草葉綠體超微結構；李全發(fā)等[12]研究了青藏高原草地植物葉解剖特征；孫會婷等[13]開展了青藏高原不同海拔3種菊科植物葉片結構變化及其生態(tài)適應性的研究；潘紅麗等[2,18]研究臥龍油竹子形態(tài)學特征、地上部生物量以及生理生態(tài)特征對海拔的響應，發(fā)現油竹子的生長受降水以及不同海拔環(huán)境影響較大，其中竹組織中葉比枝、干及根對海拔變化更敏感；Liu等[19]研究縉云山的斑苦竹在不同水分條件下的形態(tài)可塑性；吳杰等[3，14]在對臥龍林下小徑竹生理生態(tài)特性比較研究表明，油竹子和華西箭竹生長季前比葉面積在海拔上呈非線性變化同時對臥龍竹類非結構性碳水化合物與葉氮含量對海拔的響應進行了研究。根據李振宇等[20]、陳緒玲等[21]的研究以及筆者實地踏查，慈竹(Neosinocalamusaffinis)、八月竹(Chimonobambusaszechuanensis)和短錐玉山竹(Yushaniabrevipaniculata)在峨眉山不同海拔廣泛分布，分別為600～1 000 m的低山竹、1 600～2 400 m的半山竹、2 500～3 000 m的高山竹。本文以此3種在不同海拔高度廣泛分布的代表性竹為研究對象，采用統計分析和電鏡掃描技術，旨在研究以下2個問題：(1)竹葉片形態(tài)、解剖結構隨海拔變化的特點和規(guī)律；(2)竹葉片解剖因子的可塑性與海拔的關系。以期為深入研究竹類對環(huán)境的適應性提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究地概況

峨眉山位于四川盆地向青藏高原的過渡地帶(29°31′～38′N，103°15′～28′E)，大部分地形屬于剝蝕背斜褶皺斷塊山，屬于中亞熱帶季風氣候區(qū)域，年均氣溫為17.29 ℃，海拔落差2 700 m，最大溫差可達14 ℃。峨眉山具有典型的垂直氣候特征，其生物氣候垂直帶明顯，海拔1 800 m以下為常綠闊葉林帶，海拔1 800～2 200 m為常綠闊葉林與落葉闊葉混交林帶，海拔2 200～2 600 m為針闊混交林帶，海拔2 600 m以上為針葉林帶[5,20-22]。

1.2 實驗材料

采集慈竹、八月竹、短錐玉山竹3種竹新鮮成熟葉片，以經歷旺盛生長季后11月初期的竹葉片進行研究。海拔高度100 m設置1個樣地，每個樣地的坡向、坡度等基本一致。參照孫會婷等[13]的方法，每個樣地隨機選取10 株發(fā)育程度相近的成熟植株，在植株中部相同的位置采集健康成熟的葉片3片、共計30片進行表型統計，然后隨機選取5片，在葉片中部以主脈為中心剪取5 mm×5 mm大小放入FAA固定液中固定(體積分數為70%乙醇90 mL、甲醛5 mL、冰乙酸5 mL的混合液)，帶回實驗室后放入4 ℃冰箱保存。植物采集地點、海拔高度信息見表1。

表1 竹子類型及其海拔高度

1.3 實驗方法

1.3.1葉片表型特征測量 葉片采集后即用精確度為0.01 mm的游標卡尺測量葉片的長度與寬度。葉片長度(以下簡稱葉長)是指葉片最大長度，葉片寬度(以下簡稱葉寬)是指葉片最大寬度，長寬比即葉長和葉寬的比值。葉面積是將采集的葉片經掃描后用Image J軟件測定。比葉面積是葉面積與干葉質量的比值，以葉長、葉寬、長寬比、葉面積及比葉面積的算術平均數進行統計分析。

1.3.2掃描電鏡觀察 電鏡掃描樣品制作方法參考王偉中等[23]的方法，將FAA固定液中的樣品快速取出，放入體積分數為4%戊二醛固定液，在4 ℃下固定2 h，磷酸緩沖液(0.1 mol·L-1)沖洗樣品3次，經體積分數為30%、50%、70%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水三次，每次用乙酸異戊脂置換15 min，再經二氧化碳臨界干燥，離子濺射儀鍍金屬膜后在InspectF 50型掃描電鏡下觀察葉片斷面及下表面并拍照。用Image J軟件測量統計葉片厚度、維管束長度、維管束寬度、上表皮厚度、下表皮厚度等5項指標及氣孔密度、氣孔面積等2個指標，每項指標重復測量10次，并計算出他們所對應的可塑性指數(PI)。本文中對竹葉片解剖結構進行描述的專業(yè)術語參考陳守良等[24-25]。

1.4 數據處理

利用Excel軟件(2016)對數據進行統計和作圖，利用SPSS 19.0軟件進行方差分析和相關性分析。差異顯著性分析用Duncan′s檢驗方法，P<0.05為差異顯著。相關性分析用雙側檢驗，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同海拔葉片表型特征變化

經測定，對峨眉山3種竹葉片表型特征比較的結果如表2所示，3種竹葉片的表型特征對海拔梯度響應的變化趨勢不同。

2.1.1慈竹 慈竹的葉長、葉寬、葉面積、比葉面積隨海拔升高呈現出不同的變化趨勢，葉長、葉面積峰值出現在海拔700 m；葉寬、比葉面積峰值在海拔600 m；海拔900 m葉長、葉寬、比葉面積均為最低。慈竹葉長、葉寬、葉面積和比葉面積均與海拔高度呈極顯著負相關(相關系數r分別為-0.590、-0.569、-0.282、-0.508，P<0.01)；葉片長寬比隨海拔升高呈上升趨勢，與海拔高度呈極顯著正相關(r=0.336**，P<0.01)。

2.1.2八月竹 八月竹葉長、葉面積隨海拔升高整體呈下降趨勢，海拔1 600 m葉長值20.27 cm、葉寬2.63 cm均為最大，葉面積和比葉面積也最大；分布區(qū)域上限(海拔2 400 m處)，其葉長、葉寬、葉面積、比葉面積均大幅度降至最低值。經統計分析，八月竹的葉長、葉寬、葉面積、比葉面積與海拔高度存在極顯著負相關(相關系數r分別為-0.780、 -0.652、-0.705、-0.642，P<0.01)；葉長寬比與海拔無顯著相關性(r=-0.126,P=0.091)。

表2 慈竹、八月竹、短錐玉山竹葉片不同海拔的表型特征比較

說明：同一列不同小寫字母表示在0.05水平下差異顯著

2.1.3短錐玉山竹 短錐玉山竹葉長、葉寬隨海拔升高呈下降趨勢明顯，葉面積和比葉面積隨海拔升高波動較大。葉長、葉寬、葉面積、比葉面積峰值在2 500 m處最大，但在最低值并未全部出現在分布上限處。葉長、葉寬、葉面積、比葉面積與海拔高度有極顯著的負相關關系(相關系數r分別為-0.726、-0.683、-0.313、-0.404，P<0.01)；葉長寬比與海拔無顯著相關性(r=0.108,P=0.242)。

2.2 葉片超顯微結構特征變化

通過掃描電鏡觀察發(fā)現，慈竹、八月竹和短錐玉山竹葉片均為等面葉，葉肉組織無柵欄組織和海綿組織的分化(圖1～3)。其中3種竹葉表面的附屬物等差異明顯，慈竹葉片下表面可觀察到裸露的氣孔，而八月竹及短錐玉山竹氣孔均被乳突所掩蓋(圖4、圖8)。在不同海拔下，3種竹葉上、下表皮表面均有一層較厚的角質層，且上表皮厚度明顯大于下表皮厚度。從葉片橫斷面均可觀察到維管束，以及其周圍的氣腔結構。經測量分析表明，慈竹、八月竹和短錐玉山竹葉片的葉片厚度、維管束長度、維管束寬度以及上下表皮厚度的大小在不同海拔之間差異顯著(P<0.05 )。對3種竹葉的超顯微特征進行可塑性分析，結果表明3種竹均有較大的可塑性(表3)。

UE.上表皮Upper epidermis；LE.下表皮Lower epidermis；VB.維管束Vascular bundle；AC.氣腔Air cavity1 000X，(1)600 m,(2)700 m,(3)800 m,(4)900 m,(5)1 000 m, 2 000X，(6)600 m,(7)700 m,(8)800 m,(9)900 m,(10)1 000 m圖1 不同海拔高度慈竹葉片結構特征Fig.1 The leaf structure of N. affinis at different altitudes

指標Index可塑性指數 Plasticity index慈竹N. affinis八月竹C. szechuanensis短錐玉山竹Y. brevipaniculata葉片厚度Leaf thickness0.180.350.17維管束長度Vascular bundle length0.370.580.34維管束寬度Vascular bundle width0.580.410.31上表皮厚度Upper epidermis thickness0.160.320.24下表皮厚度Lower epidermis thickness0.190.390.36

說明：可塑性指數(PI=1-x/X，x為種群間最小平均數，X為種群間最大平均數

UE.上表皮Upper epidermis；LE.下表皮Lower epidermis；VB.維管束Vascular bundle；AC.氣腔Air cavity(1)1 600 m,(2)1 700 m,(3)1 800 m,(4)1 900 m,(5)2 000 m,(6)2 100 m,(7)2 200 m,(8)2 300 m,(9)2 400 m圖2 不同海拔高度八月竹葉片結構特征Fig.2 The leaf structure of C. szechuanens at different altitudes

UE.上表皮Upper epidermis；LE.下表皮Lower epidermis；VB.維管束Vascular bundle；AC.氣腔Air cavity(1)2 500 m,(2)2 600 m,(3)2 700 m,(4)2 800 m,(5)2 900 m,(6)3 000 m圖3 不同海拔高度短錐玉山竹葉片結構特征Fig.3 The leaf structure of Y. brevipaniculata at different altitudes

2.2.1慈竹 慈竹上表皮較光滑，附著物少，而下表皮附著物較多，下表皮附有長毛、刺毛等表皮毛及乳突，乳突排列整齊成列，氣孔分布其中呈裸露。隨海拔升高，長毛長度減小，表皮毛數量呈下降趨勢，但乳突的排列愈加緊密，同時氣孔周圍的乳突距離縮小(圖4)。氣孔密度隨海拔升高而增大，氣孔面積則呈下降趨勢(表4)。葉片結構由表皮、維管束及在維管束周圍的許多大小不一明顯的氣腔結構組成(圖1)。維管束長度(r=-0.835**，P<0.01)、寬度(r=-0.831**，P<0.01)與海拔呈顯著的負相關關系；葉片厚度(r=0.448**，P<0.01)與海拔呈極顯著正相關(圖5)；上表皮厚度(r=0.175，P=0.532)和下表皮厚度(r=-0.298，P=0.280)與海拔之間的相關性不顯著。慈竹維管束寬度在不同海拔高度下可塑性最大，其可塑性指數為0.58，其次是維管束長和下表皮厚度，葉片厚度及上表皮厚度可塑性指數分別為0.18和0.16，可塑性顯著小于其他指標(表3)。

S .氣孔stoma P.乳突Papilla；MH.大毛 Macro-hair；PH.刺毛Prickle-hair1 000X，(1)600 m,(2)700 m,(3)800 m,(4)900 m,(5)1 000 m, 2 000X，(6)600 m,(7)700 m,(8)800 m,(9)900 m,(10)1 000 m圖4 不同海拔梯度慈竹葉下表皮Fig.4 Lower epidermis of the N. affinis at different altitudes

圖5 不同海拔梯度慈竹葉片解剖結構數量指標變化Fig.5 The leaf anatomical quantitative index of N.affinis at different altitude注：不同小寫字母表示在0.05水平下差異顯著，下同。Note: The different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level, same as below

2.2.2八月竹 八月竹上表皮表面光滑，下表皮無長毛，但有刺毛(圖2)；不同海拔高度葉片下表皮密布大小乳突，氣孔器被乳突所掩蓋(圖8)。葉片厚度(r=0.464**，P<0.01)、上表皮厚度(r=0.491**，P<0.01)與海拔有顯著的正相關關系；維管束長度(r=-0.899**，P<0.01)、寬度(r=-0.947**，P<0.01)與海拔有顯著的負相關關系；下表皮厚度(r=0.100，P=0.514)與海拔之間相關性不顯著(圖6)。八月竹的維管束長度在不同海拔高度上可塑性最大，可塑性指數達0.58，葉片厚度、上下表皮厚度可塑性分別為0.35、0.32、0.39，整體可塑性明顯大于其他兩種竹(表3)。

表4 不同海拔高度慈竹的氣孔密度及氣孔面積

圖6 不同海拔梯度八月竹葉片解剖結構數量指標變化Fig.6 The leaf anatomical quantitative index of C. szechuanensis at different altitudes

2.2.3短錐玉山竹 短錐玉山竹葉片上表皮較粗糙，有刺毛，下表皮有乳突，且乳突密度較八月竹高，氣孔器被乳突掩蓋(圖8)。葉片厚度(r=0.400**，P<0.01)與不同海拔之間呈顯著的正相關關系；維管束長度(r=-0.911**，P<0.01)、寬度(r=-0.835**，P<0.01)和上表皮厚度(r=-0.556**，P<0.01)、下表皮厚度(r=-0.652**，P<0.01)與海拔有顯著的負相關(圖7)。短錐玉山竹的下表皮厚度的可塑性最大達0.36，可塑性最小的是葉片厚度0.17，維管束長、寬的可塑性也較大(表3)。

圖7 不同海拔梯度短錐玉山竹葉片解剖結構數量指標變化Fig.7 The leaf anatomical quantitative index of Yushania brevipaniculata at different altitudes

(1)(3) 1 600m(C. szechuanens);(2)(4) 2 500 m(Y. brevipaniculata). S.氣孔stoma圖8 不同海拔梯度八月竹及短錐玉山竹葉下表皮Fig.8 Lower epidermis of the C. szechuanensis and Y. brevipaniculata at different altitudes

3 結論與討論

本研究發(fā)現慈竹、八月竹、短錐玉山竹3種不同海拔高度分布的竹種雖然葉片長、寬、葉面積及比葉面積的絕對值差異較大，但不同竹種間的葉寬比的差異卻較小，受海拔的影響程度也明顯不同。隨分布范圍內的海拔梯度變化，分布于低海拔區(qū)的慈竹葉長、葉寬、長寬比、葉面積及比葉面積均達到極顯著差異水平，而分布于較高海拔區(qū)域的八月竹和短錐玉山竹的長寬比差異不顯著，其中分布于半山區(qū)的八月竹除長寬比外的各項參數與海拔的相關性差異極顯著。由此表明，隨分布范圍內的海拔梯度變化，不同竹種的葉片表型特征變化程度不同，同一竹種葉片的不同表型特征變化趨勢和差異顯著性不完全相同：分布于1 000 m以下低海拔區(qū)的慈竹葉片表型隨海拔梯度變化差異極顯著，其表型特征可塑性較強；分布于2 500～3 000 m海拔區(qū)的短錐玉山竹的葉面積、比葉面積最小，分布于中低海拔的八月竹、慈竹次之。根據Reich等[26]的研究，比葉面積小的植物通常葉片較厚而面積較小，葉片很大一部分都用于構建自我保衛(wèi)構造，說明短錐玉山竹對逆境的忍耐性優(yōu)于慈竹和八月竹。

3種竹葉片都是等面葉，無葉肉組織的分化，上、下表皮表面均有較厚的角質層，但3種竹葉片下表皮結構不完全相同，分布于600～1 000 m海拔的慈竹氣孔裸露，分布于中高海拔的八月竹及短錐玉山竹氣孔均被乳突掩蓋。隨海拔升高，葉下表皮乳突排列越來越緊密且與氣孔距離越來越近，葉片厚度均與海拔梯度變化呈顯著正相關，維管束長度、寬度均與海拔梯度變化呈顯著負相關。此表明，不同竹種葉片通過增加葉下表皮乳突數量、乳突掩蓋氣孔、增加葉片厚度、減少維管束長寬度來適應高海拔條件下的逆境。

施海燕等[16]對青藏高原7種風毛菊葉片的研究結果以及戴葉輝等[27]對13種榕屬植物的研究中提出的“在植物進化過程中異面葉比等面葉更適應高海拔環(huán)境”，與本研究結果存在差異，慈竹、八月竹及短錐玉山竹在峨眉山不同海拔均為優(yōu)勢物種。異面葉中發(fā)達的柵欄組織和海綿組織是植物對環(huán)境的一種適應，可保護葉片，竹類為等面葉在峨眉山廣泛分布，這可能竹子為典型的克隆植物、異質生境適應能力突出的特殊屬性有關[28]。氣孔被乳突所掩蓋可減少水分散失，是中高海拔竹種應對干旱環(huán)境脅迫的結果。3種竹葉片厚度隨海拔升高而顯著升高，葉片小而厚是對強光、低溫的適應，這與姜永雷等[8]，王元元等[15]，施海燕等[16]，李芳蘭等[17]的結果一致。

根據Gratani等[29]對葉片可塑性的研究表明，可塑性在對環(huán)境的適應性中是有利的，可塑性大的植物，其分布更廣泛。從本研究結果可知：八月竹葉片結構多數指標的可塑性指數均優(yōu)于慈竹和短錐玉山竹，此表明八月竹對海拔梯度變化具有較強的可塑性和逆境適應性，這可能是八月竹在中高海拔地區(qū)分布多而廣的原因。慈竹在海拔1 000 m以下主要表型特征隨海拔梯度變化極顯著變化，表現出較強的表型特征可塑性，可能是他們在四川低海拔區(qū)域分布數量較多的重要原因。

本研究分析了不同竹種對分布范圍內海拔梯度垂直變化的形態(tài)適應機制，即以葉長、葉寬和葉長寬比等表型特征的顯著改變及葉片厚度、維管束長寬度、乳突數量等結構特征的顯著變化來適應環(huán)境的顯著變化。本研究結果對研究竹類的生態(tài)適應性和分布具有重要的科學意義和現實價值。