廖云鵬，何 芳，江 芬,4，王 涵，朱茄慧，馬 妍，胡 瑩，李福書，李 沁，周 婭，何百成

(1. 重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科,重慶 400016;4. 湖北省蘄春縣人口和計(jì)劃生育服務(wù)中心,湖北 蘄春 436300)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是引起心血管相關(guān)疾病發(fā)病率和病死率升高的重要原因之一。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)鈣化是CKD的并發(fā)癥之一，該過程可能是由高鈣和(或)高磷引起[1-2]。文獻(xiàn)報(bào)道，高磷誘導(dǎo)血管鈣化的作用與促進(jìn)細(xì)胞凋亡和成軟骨分化有關(guān)[3]。參與該病理過程的信號包括BMPs/Smads、Wnt/β-catenin信號等[4]。血管鈣化和骨形成有很多相似之處，BMPs屬于TGF-β超家族成員，對骨發(fā)生、發(fā)育和骨折愈合具有重要調(diào)節(jié)作用，目前發(fā)現(xiàn)20余種BMPs。其中，BMP2和BMP7具有成骨分化誘導(dǎo)能力，已被FDA批準(zhǔn)用于脊柱融合以及骨移植的融合治療[5]。 BMP9與BMP2具有相似的成骨誘導(dǎo)作用，且誘導(dǎo)成骨分化能力明顯強(qiáng)于BMP2[6]。文獻(xiàn)報(bào)道，BMP9可通過ALK1依賴的方式誘導(dǎo)VSMCs鈣化[7]。但是，在血管鈣化過程中，BMP9與磷酸鹽的關(guān)系以及BMP9誘導(dǎo)血管鈣化的詳細(xì)機(jī)制并不明確。環(huán)氧酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)作為一種促炎因子，是前列腺素合成的限速酶。此外，COX-2也參與骨折愈合以及干細(xì)胞骨分化的調(diào)節(jié)。研究顯示，敲除COX-2能引起骨折愈合延遲，COX-2抑制劑能夠減輕臨床外科手術(shù)術(shù)后的異位骨化[8]。BMP9在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)骨向分化時(shí)，能促進(jìn)COX-2表達(dá)[8]。因此，COX-2可能對VSMCs鈣化有促進(jìn)作用。但也有相關(guān)研究顯示，抑制COX-2能促進(jìn)VSMCs鈣化，即COX-2可能具有降低血管鈣化的作用[9]。這種現(xiàn)象可能與所用細(xì)胞和誘導(dǎo)因子的不同，以及微環(huán)境有關(guān)。但是，COX-2在VSMCs鈣化中的作用需要進(jìn)一步明確。本研究主要探索BMP9與高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化的關(guān)系， COX-2與BMP9誘導(dǎo)VSMCs鈣化的關(guān)系，以及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂ SD大鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號：SCXK (渝) 2017-0001。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)規(guī)定。

1.1.2試劑 所用一抗均購自圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz)；COX-2抑制劑(NS-398)購自Sigma-Aldrich公司。

1.1.3儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；定量PCR儀及凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；電泳儀、垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)。

1.2原代大鼠VSMCs的分離與培養(yǎng)用頸椎脫臼法處死大鼠，取主動(dòng)脈血管，小心地去除內(nèi)層和外層血管平滑肌，收集中層平滑肌并切分成小部分，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將VSMCs培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素以及100 μg·L-1鏈霉素的高糖DMEM中。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是VSMCs的特異性標(biāo)志物，提取的原代細(xì)胞經(jīng)α-SMA免疫熒光檢測，超過90%的細(xì)胞為VSMCs。本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞為第3～8代。

1.3重組腺病毒BMP9、COX-2、綠色熒光蛋白載體(GFP)構(gòu)建重組腺病毒采用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建。用PCR將BMP9、COX-2以及GFP編碼序列擴(kuò)增，然后克隆到穿梭載體上。然后將穿梭質(zhì)粒與AdEasy-1質(zhì)粒在BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行重組。最后將重組好的質(zhì)粒線性化，并轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞進(jìn)行重組腺病毒包裝。重組GFP腺病毒作為載體對照。研究BMP9對VSMCs及離體器官培養(yǎng)影響時(shí)，用低、中、高BMP9腺病毒(AdBMP9)滴度處理。

1.4總RNA提取、cDNA制備及PCR實(shí)驗(yàn)總RNA用TRIzol提取，采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。所得產(chǎn)物稀釋5～10倍作為real-time PCR的模板。所有的結(jié)果都使用GAPDH作為內(nèi)參。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列見Tab 1。

Tab 1 The primer sequences used for this investigation

1.5蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞種于6孔板中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)處理因素。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)裂解細(xì)胞，并煮沸10 min。將樣品在SDS-PAGE中分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，用10%的脫脂奶粉封閉。用相應(yīng)的一抗和二抗分別進(jìn)行孵育，最后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光法測定靶蛋白表達(dá)情況。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6茜素紅染色實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞種于24孔板，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)處理因素，14 d后進(jìn)行檢測。染色過程簡述如下：將細(xì)胞用0.05%的戊二醛在室溫固定10 min，然后用PBS洗2次。最后用0.4%茜素紅染料孵育5 min，小心洗去染料。茜素紅的定量分析采用10%乙酸溶解，吸光度測定波長為405 nm。 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7主動(dòng)脈環(huán)器官離體培養(yǎng)胸主動(dòng)脈取自♂ SD大鼠，將血管切割成2～3 mm厚度的動(dòng)脈環(huán)，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。用AdGFP、AdBMP9、NS-398和(或)AdBMP9處理主動(dòng)脈環(huán)7、14 d。標(biāo)本用10%褔爾馬林固定后，用石蠟包埋、切片，進(jìn)行組織化學(xué)染色。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8VonKossa染色石蠟包埋的主動(dòng)脈切片在紫外光下2%硝酸銀處理60 min，用雙蒸水清洗5 min；然后用5%硫代硫酸鈉處理2 min，再用雙蒸水清洗5 min，蘇木精伊紅復(fù)染1～2 min。乙醇脫水后，用二甲苯透明處理，最后進(jìn)行封片，并在顯微鏡下拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1磷與VSMCs鈣化的關(guān)系Fig 1免疫熒光檢測結(jié)果顯示，超過90%的細(xì)胞α-SMA表達(dá)陽性。蛋白印跡的結(jié)果顯示，磷酸鹽一方面下調(diào)α-SMA表達(dá)，另一方面則增加Runx2、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、骨鈣素(osteocalin, OCN)的表達(dá)。茜素紅染色結(jié)果顯示，磷酸鹽明顯誘導(dǎo)VSMCs礦化。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，高濃度磷酸鹽可誘導(dǎo)VSMCs鈣化。

2.2高磷對VSMCs中BMP9表達(dá)的影響Fig 2的Western blot結(jié)果顯示，高磷能上調(diào)BMP9在VSMCs中的表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果顯示，高表達(dá)BMP9能上調(diào)Runx2、Dlx-5、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的mRNA水平，但降低SM22α的水平。以上結(jié)果提示，BMP9可能參與磷酸鹽誘導(dǎo)VSMCs鈣化的過程。

Fig 1 Effects of phosphate on inducing calcification in VSMCs

Fig 2 Effects of BMP9 on expression of early osetogenic markers in VSMCs

2.3BMP9對VSMCs與胸主動(dòng)脈鈣化的影響Fig 3的Western blot分析結(jié)果顯示，過表達(dá)BMP9能上調(diào)OPN和OCN的水平，但降低α-SMA的蛋白水平。同時(shí)，BMP9也能直接在VSMCs中明顯誘導(dǎo)礦化。ALK2突變能明顯降低BMP9在VSMCs中誘導(dǎo)鈣鹽沉積的能力。主動(dòng)脈環(huán)硝酸銀染色結(jié)果顯示，過表達(dá)BMP9也能明顯促進(jìn)血管平滑肌鈣化。以上結(jié)果提示，BMP9能誘導(dǎo)血管鈣化，但具體機(jī)制還不清楚。

Fig 3 Effects of BMP9 on calcification in VSMCs and thoracic aorta

2.4磷酸鹽對VSMCs中COX-2表達(dá)的影響Fig 4的Western blot分析結(jié)果顯示，磷酸鹽呈濃度依賴性上調(diào)COX-2水平。同時(shí)，BMP9也能明顯增加COX-2在VSMCs中的水平。以上結(jié)果提示，COX-2可能也參與血管鈣化的過程。

2.5COX-2對BMP9誘導(dǎo)VSMCs與胸主動(dòng)脈鈣化的影響Fig 5的Western blot分析結(jié)果顯示，過表達(dá)COX-2能增強(qiáng)BMP9下調(diào)α-SMA和促進(jìn)OPN與OCN表達(dá)的作用；COX-2抑制劑(NS-398)能減弱BMP9下調(diào)α-SMA和促進(jìn)OPN與OCN表達(dá)的作用。茜素紅染色結(jié)果顯示，BMP9能明顯誘導(dǎo)VSMCs鈣化，但NS-398可明顯減弱BMP9的這種作用。以上結(jié)果表明， COX-2可能參與介導(dǎo)BMP9誘導(dǎo)VSMCs鈣化的作用。

Fig 4 Effects of phosphate on expression of COX-2 in VSMCs

Fig 5 Effects of COX-2 on BMP9-induced calcification in VSMCs and thoracic aorta

3 討論

血管鈣化是CKD的主要并發(fā)癥之一，但VSMCs鈣化的具體分子機(jī)制迄今仍不明確。本研究證實(shí)，磷酸鹽能誘導(dǎo)VSMCs鈣化并促進(jìn)BMP9的表達(dá)； 同時(shí)，BMP9能直接誘導(dǎo)VSMCs鈣化，磷酸鹽及BMP9均能誘導(dǎo)COX-2表達(dá)，且COX-2可能參與介導(dǎo)BMP9誘導(dǎo)VSMCs鈣化的作用。

來自血管壁的VSMCs可以分化為成骨樣細(xì)胞[10]，這一過程可能與BMPs/Smads和Wnt/β-catenin信號活性增加有關(guān)[11],也提示高磷誘導(dǎo)VSMCs血管鈣化可能也與上述因素有關(guān)。BMPs作為促進(jìn)骨發(fā)育和骨折修復(fù)的因子，能誘導(dǎo)干細(xì)胞骨向分化，其中BMP2和BMP7已經(jīng)被證實(shí)參與血管鈣化的過程[12]。BMP2能增加血液中磷酸鹽水平，并參與RANKL促進(jìn)VSMCs鈣化的過程。出生以后，BMP7主要在腎臟中表達(dá)，并參與調(diào)控骨重建和VSMCs的表型；同時(shí)，BMP7的多態(tài)性對血管鈣化也存在不同的影響[13]。BMP9是目前研究相對較少的BMP成員，但其誘導(dǎo)MSCs骨向分化的能力明顯強(qiáng)于其他BMPs。據(jù)報(bào)道，BMP9可通過經(jīng)典BMPs/Smads和非經(jīng)典BMPs/Smads信號發(fā)揮作用，其受體可能主要是ALK1和ALK2[14]。BMP9除能誘導(dǎo)MSCs骨向分化外，還可經(jīng)ALK1依賴的方式誘導(dǎo)VSMCs鈣化。但是，高磷酸鹽誘導(dǎo)VSMCs鈣化是否與BMP9有關(guān)，目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，磷酸鹽以濃度依賴性方式增加BMP9在VSMCs中表達(dá)。過表達(dá)BMP9能誘導(dǎo)VSMCs鈣化，并降低α-SMA的水平；ALK2突變明顯降低BMP9在VSMCs中誘導(dǎo)鈣鹽沉積的能力。結(jié)果表明，高磷酸鹽誘導(dǎo)VSMCs鈣化與促進(jìn)BMP9表達(dá)有關(guān)，BMP9本身可以通過依賴ALK1和ALK2的方式誘導(dǎo)VSMCs鈣化。但是，BMP9誘導(dǎo)VSMCs鈣化的具體機(jī)制仍不清楚。

炎癥與多種疾病有關(guān)，包括血管平滑肌鈣化。一些炎癥因子也參與VSMCs鈣化的過程，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。高磷水平可以誘導(dǎo)血管平滑肌鈣化，同時(shí)也可以激活炎癥系統(tǒng)。COX-2是主要的炎癥誘導(dǎo)因子之一，其抑制劑在臨床上作為抗炎鎮(zhèn)痛和解熱藥物使用。但是，磷酸鹽誘導(dǎo)血管鈣化與COX-2的關(guān)系目前還尚不明確。我們前期的研究顯示，在MSCs骨向分化的過程中，BMP9能明顯上調(diào)COX-2表達(dá)；沉默或抑制COX-2能明顯減弱BMP9誘導(dǎo)MSCs骨向分化的作用[8]。因此，我們推測在VSMCs中，高磷促進(jìn)BMP9表達(dá)的同時(shí)，也會(huì)上調(diào)COX-2，且COX-2可能也參與BMP9誘導(dǎo)的VSMCs鈣化。研究結(jié)果顯示，高磷能增加COX-2的表達(dá)；在VSMCs細(xì)胞中，過表達(dá)COX-2能促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的成骨指標(biāo)表達(dá)；相反，COX-2抑制劑則明顯減弱BMP9的這種作用。但是，也有研究表明COX-2有逆轉(zhuǎn)血管鈣化的功能[15]。COX-2對鈣化的不同影響可能與誘導(dǎo)因子的不同、抑制劑的濃度以及微環(huán)境不同有關(guān)。

本研究顯示，高磷酸鹽誘導(dǎo)VSMCs鈣化與促進(jìn)BMP9表達(dá)有關(guān)；同時(shí)，BMP9能誘導(dǎo)VSMCs鈣化，該作用可能與上調(diào)COX-2表達(dá)有關(guān)。結(jié)果提示，非甾體類藥物可能在臨床對血管鈣化具有一定的預(yù)防作用。

[致謝：本研究的主要工作完成于重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，課題組感謝芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心何通川教授(T.C. He)為本研究提供重組腺病毒。]