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苦參堿聯(lián)合黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠肺炎的影響

2018-07-27 08:20孫耀貴范闊海段智變李宏全
中國藥理學(xué)通報(bào) 2018年8期
關(guān)鍵詞:苦參堿黃芩肺泡

王 芳,孫耀貴,尹 偉,范闊海,段智變,孫 娜,李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

苦參堿和黃芩苷分別是從苦參和黃芩中提取的天然化合物,二者分別屬于生物堿類和黃酮類。已有大量文獻(xiàn)表明苦參堿和黃芩苷均具有抗炎作用,如Wu等[1]的研究已證明苦參堿可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的腸炎和氧化應(yīng)激,抑制炎癥因子白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素17(interleukin 17,IL-17)的分泌,且已證實(shí)是通過CCR7通路發(fā)揮其抗炎作用。黃芩苷能明顯減弱滑膜組織中成纖維細(xì)胞的增殖及炎性損傷程度,降低滑膜組織中Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的表達(dá)[2],也可以有效減輕肝損傷引起的氧化應(yīng)激和炎癥因子的產(chǎn)生[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,苦參堿對(duì)豬藍(lán)耳病毒和圓環(huán)病毒共感染引起的小鼠間質(zhì)性肺炎有緩解作用[4]。雖然研究已表明苦參堿[5]和黃芩苷[6]有抑制肺炎作用,但對(duì)二者的聯(lián)合作用并未進(jìn)行研究。聯(lián)合用藥可以提升藥效或減少用藥量,并可通過作用多靶點(diǎn)來發(fā)揮藥效,降低抗藥性。本實(shí)驗(yàn)以LPS誘導(dǎo)的小鼠肺炎為模型,考察苦參堿和黃芩苷聯(lián)合用藥的效果,為苦參堿和黃芩苷組方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)♀昆明小鼠(合格證號(hào):11400777254421),體質(zhì)量18~22 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下(溫度23~25 ℃,相對(duì)濕度40%~70 %,12 h光/暗周期),通風(fēng)良好的動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)前7 d,小鼠自由采食,以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2藥物與試劑 LPS(大腸桿菌055 ∶B5)購自Solarbio公司;苦參堿和黃芩苷購自南京澤朗生物科技有限公司,濃度≥98%。DMEM高糖培養(yǎng)基購于Hyclone公司;小鼠白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)ELISA試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒,購于上海藍(lán)基生物科技有限公司;TRIzol試劑盒購于Biomiga公司;兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司;DNA Marker購于中科瑞泰(北京)生物科技有限公司;引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成;髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)測(cè)試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器 ND-1000核酸蛋白濃度測(cè)定儀(美國NanoDrop);DYY-7型轉(zhuǎn)移電泳儀(北京市六一儀器廠);7500定量PCR儀(美國ABI公司);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);UV 2800雙光束紫外分光光度計(jì)(上海奧譜勒儀器有限公司);Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2方法

1.2.1藥物配制 稱取適量的苦參堿和黃芩苷,用DMEM培養(yǎng)基將苦參堿和黃芩苷溶解到終濃度為30 mg·kg-1和200 mg·kg-1,然后將二者的混合物進(jìn)行連續(xù)的2倍稀釋,配成中劑量和低劑量。之后將配好的藥物溶液置37℃水浴鍋備用。

1.2.2動(dòng)物分組與模型制備 將42只小鼠隨機(jī)分為7組(n=6),具體分組為:空白組、LPS組、苦參堿(30 mg·kg-1)組、黃芩苷(200 mg·kg-1)組、聯(lián)合高劑量組(苦參堿30 mg·kg-1+黃芩苷200 mg·kg-1)、聯(lián)合中劑量組(苦參堿15 mg·kg-1+黃芩苷100 mg·kg-1)、聯(lián)合低劑量組(苦參堿7.5 mg·kg-1+黃芩苷50 mg·kg-1)。采用腹腔注射LPS的方法制備小鼠肺炎模型。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射LPS 20 mg·kg-1(0.01 mL·g-1),空白組腹腔注射等體積的PBS。加藥組于造模后30 min腹腔注射藥物,空白組和LPS組腹腔注射等體積的DMEM。LPS刺激24 h后,摘眼球放血致死,采集全肺。

1.2.3肺組織病理學(xué)觀察 取左肺大葉組織,切兩半,用苦味酸溶液固定24 h后,脫水、透明、石蠟包埋,行5 μm厚切片,然后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,光鏡下觀察小鼠肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4血清TNF-α、IL-6的測(cè)定 眼球取血后,4℃過夜,3 000 r·min-1、4℃離心10 min,收集血清,于-80 ℃保存。采用ELISA法,按試劑盒說明書檢測(cè)TNF-α、IL-6濃度。終止反應(yīng)后,將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀槽內(nèi),選擇450 nm波長檢測(cè),確定標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照區(qū)域,檢測(cè)相應(yīng)的光密度(optical density,OD)值,然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算相應(yīng)的濃度。

1.2.5qPCR測(cè)定小鼠肺組織中IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)量 取-80℃凍存的右下肺組織放到研缽中,充分碾磨后,加入1 mL裂解液,按步驟提取總RNA,測(cè)定樣品A260/A230和A260/A280。反轉(zhuǎn)錄后使用qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)樣品平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,引物序列見Tab 1。采用ΔΔCt法,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,對(duì)各樣本IL-6、TNF-α mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析,計(jì)算RQ值(2-ΔΔCt)。

Tab 1 Primer sequences and product size

1.2.6小鼠肺組織MPO活性測(cè)定 采用MPO檢測(cè)試劑盒。取右上肺,肺組織稱重,剪切,勻漿。對(duì)照管加3 mL雙蒸水、0.2 mL試劑四、0.2 mL樣本;測(cè)定管加3 mL顯色劑、0.2 mL試劑四和0.2 mL樣本?;靹?,37℃水浴30 min。之后,每管加0.05 mL試劑七?;靹?,60 ℃水浴10 min,取出后立即在460 nm處,1 cm光徑,雙蒸水調(diào)零,測(cè)各管吸光度值。并根據(jù)說明書對(duì)MPO活性進(jìn)行分析。計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果

2.1小鼠一般情況空白組小鼠表現(xiàn)正常,活潑,反應(yīng)靈敏;模型組小鼠腹腔注射LPS后,反應(yīng)變遲鈍,行動(dòng)緩慢,飲食減少,被毛豎起,呼吸加快,全身顫抖,抱團(tuán)。各給藥組與LPS組小鼠相比,精神狀態(tài)較好,活動(dòng)量增多,飲食量也增加,整體狀態(tài)比LPS組好。

2.2肺組織切片病理形態(tài)學(xué)變化Fig 1的小鼠肺組織切片HE染色顯示,空白組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔內(nèi)無分泌物和炎性細(xì)胞浸潤,肺泡壁厚度正常。LPS組小鼠肺組織病變嚴(yán)重,發(fā)生實(shí)變,結(jié)構(gòu)不清晰,肺泡腔里有炎性細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出,肺泡間隔增厚,血管充血。給藥組與LPS組相比,肺組織病變明顯改善,肺泡壁變薄,肺泡腔炎性細(xì)胞減少,充血現(xiàn)象也有所減輕,與空白組相比肺泡壁仍厚。

2.3各處理組對(duì)小鼠血清IL-6、TNF-α水平的影響如Fig 2所示,與空白組相比,LPS組血清中IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.01),各給藥組與空白組相比,IL-6和TNF-α水平?jīng)]有明顯差異。與LPS組相比,各給藥組IL-6水平差異無顯著性,但是有降低趨勢(shì);黃芩苷組、聯(lián)合高、中劑量組與LPS組相比,TNF-α水平明顯降低(P<0.05),而苦參堿組和聯(lián)合低劑量組與LPS組相比TNF-α水平差異無顯著性,但有降低趨勢(shì)。各用藥組間相比,IL-6和TNF-α水平差異無顯著性。

Fig 1 Observation of histopathological changes in lungtissues of different treatment groups (×400)

Fig 2 Effects of different treatment on IL-6 andTNF-α secretion in serum n=6)

1:Control group;2:LPS group;3:Matrine group;4:Baicalin group;5:Combined high dose group;6:Combined medium dose group;7: Combined low dose group.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsLPS group.

2.4各處理組對(duì)小鼠肺組織IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示,與空白組比較,LPS組IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。與LPS組相比,各給藥組均明顯降低IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)量(P<0.01),且各用藥組間相比,IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)量差異無顯著性。

Fig 3 Effects of different treatment on IL-6 and TNF-α mRNAexpression of lung tissues n=6)

1:Control group;2:LPS group;3:Matrine group;4:Baicalin group;5:Combined high dose group;6:Combined medium dose group;7: Combined low dose group.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsLPS group.

2.5各處理組對(duì)小鼠肺組織MPO活性的影響如Fig 4所示,與空白組比較,LPS組MPO活性明顯升高(P<0.01);與LPS組相比,各給藥組均明顯降低肺組織MPO活性(P<0.05,P<0.01),且各用藥組間差異無顯著性。

Fig 4 Effects of different treatment on MPOactivities of lung tissues n=6)

1:Control group;2:LPS group;3:Matrine group;4:Baicalin group;5:Combined high dose group;6:Combined medium dose group;7: Combined low dose group.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

3 討論

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是臨床上最常見的呼吸系統(tǒng)疾病,主要發(fā)生在肺泡和肺實(shí)質(zhì),以肺水腫為主要特征,急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是其嚴(yán)重形式[7]。很多研究者通過LPS制備肺炎模型,LPS進(jìn)入機(jī)體后,可以使肺組織中大量炎性細(xì)胞趨化、遷移,最終發(fā)生浸潤,引起炎性介質(zhì)的過度表達(dá),最終導(dǎo)致ALI。Zeng等[8]用LPS制備的小鼠肺炎模型,表現(xiàn)為肺泡隔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤,主要以嗜中性粒細(xì)胞為主,肺泡間隔出現(xiàn)不同程度的增厚,血管充血。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射LPS制備小鼠肺炎模型,病理學(xué)觀察顯示,與空白組相比,模型組小鼠表現(xiàn)出特征性的肺組織病變,大量炎性細(xì)胞浸潤,充血,肺泡間隔增厚,成功建立了小鼠肺炎模型。用藥組與LPS組相比,肺部炎癥均有所改善,肺組織肺泡間隔變薄,充血現(xiàn)象減輕,說明黃芩苷、苦參堿及其二者的聯(lián)合均表現(xiàn)出很好的抗炎作用。

在ALI中,LPS可誘導(dǎo)大量的炎癥因子產(chǎn)生,并參與肺損傷的進(jìn)程。TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,在急性和慢性炎性疾病早期是一種重要的促炎細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)循環(huán)中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮,促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移并浸入支氣管肺泡腔,使其激活和脫顆粒,產(chǎn)生氧自由基,釋放顆粒酶[9]。IL-6也是由LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的炎性細(xì)胞因子。汪雪峰等[10]研究表明,莰醇可以降低血清中TNF-α、角化生長因子、IL-1β和IL-6的含量,起到改善肺炎的作用。Espírito-Santo等[11]研究表明,在小鼠足炎模型中,布拉易林可以抑制促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生,達(dá)到抑制炎癥的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組(LPS組)促炎因子IL-6和TNF-α水平明顯高于空白組,說明LPS引起了小鼠肺部的炎癥反應(yīng)。與LPS組相比,苦參堿組、黃芩苷組、聯(lián)合高、中、低劑量組明顯降低IL-6、TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量,說明各用藥組均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗炎作用。且各用藥組間及用藥組與空白組間在IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量上差異無顯著性,說明各用藥組間對(duì)肺炎的抑制作用無差異,與空白組無差異,提示抑制炎癥的效果很好。且在用藥組中,聯(lián)合低劑量組是用藥量最少的,所以從量效關(guān)系上看,聯(lián)合低劑量組的效果最好。

MPO在中性粒細(xì)胞中表達(dá)最豐富,MPO活性與肺組織中的中性粒細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)[12]。中性粒細(xì)胞有趨化、變形和黏附、吞噬及殺菌作用,在機(jī)體防御和抵抗病原菌侵襲過程中起著重要作用[13]。所以,可以通過肺組織中MPO活性的高低來判斷炎癥程度。在Yin等[14]的研究中,異氟醚可以通過降低MPO的活性,保護(hù)LPS誘導(dǎo)的大鼠肺損傷。本實(shí)驗(yàn)中,LPS組小鼠肺組織的MPO活性明顯高于空白組,說明LPS促進(jìn)了中性粒細(xì)胞的活化和產(chǎn)生,從而導(dǎo)致MPO活性升高;而苦參堿組、黃芩苷組、聯(lián)合高、中、低劑量組中肺組織的MPO活性與LPS組比較均明顯減少,且各用藥組間、用藥組與空白組間差異均無顯著性,說明用藥組可能是抑制了中性粒細(xì)胞的活化和產(chǎn)生,從而導(dǎo)致MPO活性降低。本研究結(jié)果表明,苦參堿、黃芩苷單獨(dú)作用和二者聯(lián)合作用都有很好的抗炎效果,且它們之間的抑炎效果差異無顯著性,其中聯(lián)合低劑量組用藥量最少。所以,后續(xù)我們將在7.5 mg·kg-1苦參堿和50 mg·kg-1黃芩苷聯(lián)合使用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究其最佳配伍劑量和機(jī)制。

綜上,綜合考慮用藥量和藥效,聯(lián)合低劑量組用量最少,效果與單獨(dú)用藥組差異無顯著性,相比較而言更加經(jīng)濟(jì),且用量減少也會(huì)降低藥物的毒性,所以,臨床上推薦使用苦參堿和黃芩苷聯(lián)合使用。研究表明,炎癥因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生與NF-κB通路有關(guān)[15],后續(xù)將從這條通路對(duì)苦參堿聯(lián)合黃芩苷抗炎機(jī)制進(jìn)行深入研究。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)是在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室完成,在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室的各位老師及同學(xué)的幫助致以衷心的感謝!)

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