王 博，邵美麗

西北婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安710061)

主題詞 卵巢腫瘤 細(xì)胞凋亡 @蟾毒靈 @Livin蛋白

卵巢癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，由于其早期的發(fā)病癥狀不明顯，難以提前發(fā)現(xiàn)和治療，導(dǎo)致卵巢癌病死率一直處于婦科腫瘤的首位。卵巢癌的病因不明，除了手術(shù)治療外，卵巢癌的患者多采用化療[1]?；熾m然能有效減少腫瘤細(xì)胞的繁殖和侵襲，但同時(shí)給機(jī)體帶來(lái)了嚴(yán)重的副作用及不良反應(yīng)。另外，中晚期卵巢癌化療后易復(fù)發(fā)，且具有耐藥性。因此尋找一種高效能，少副作用的藥物一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。蟾毒靈是一種蟾蜍科動(dòng)物耳后腺及背部皮膚腺分泌物提取的中藥單體，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、強(qiáng)心等多種活性，同時(shí)蟾毒靈在抗癌方面也有著巨大作用。研究表明，蟾毒靈能有效抑制多種癌細(xì)胞的增殖，有著很好的抗癌作用[2-3]。然而其對(duì)卵巢癌細(xì)胞是否同樣有抗癌作用尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)以卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探究蟾毒靈對(duì)OVCAR-3細(xì)胞活力和凋亡的影響，并初步探討其中的分子機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 ①細(xì)胞株：本研究采用人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞株，該細(xì)胞株由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科贈(zèng)予。②藥物和試劑：蟾毒靈購(gòu)買自美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)B0261)，溶解于DMSO中，配置成1 nmol/L，冷凍放置。用含血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。CCK-8試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞活力，購(gòu)買自上海源茲生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑包括DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清(四季青公司)和抗生素(碧云天公司)等。實(shí)驗(yàn)中Western blot所用試劑和抗體均購(gòu)買自CST公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中加入10%的胎牛血清，100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素，細(xì)胞孵箱的參數(shù)設(shè)置為37 ℃，二氧化碳濃度為5%。每隔兩天換一次液。②CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力：取干凈的96孔板，超凈臺(tái)下將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的OVCAR-3細(xì)胞種植于96孔板中，每孔種植3000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為0、0.1、1、10、100、500 nmol/L的蟾毒靈，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)作用24、48 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑，1 h后用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測(cè)，波長(zhǎng)450 nm。以0 nmol/L作為比照值，通過(guò)相應(yīng)數(shù)值計(jì)算回歸方程，并根據(jù)方程求得IC50。③流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OVCAR-3細(xì)胞，種植于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)2×105/ml，培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度(0、1、10、100 nmol/L)的蟾毒靈，待刺激時(shí)間達(dá)到24 h收集細(xì)胞。按照流式細(xì)胞正規(guī)操作流程，加入Annexin-V和PI，尼龍網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。④Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)：細(xì)胞刺激過(guò)程與流式檢測(cè)中相同，之后收集細(xì)胞，利用試劑盒進(jìn)行蛋白提取。定量后，煮沸10 min，加入12% SDS-PAGE凝膠垂直電泳分離系統(tǒng)。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜。5%的BSA稀釋一抗，孵育Livin(1∶400)，β-actin(1∶5000)和Caspase-3(1∶400)一抗，4℃過(guò)夜。清洗膜多次后，孵育二抗1 h。加入顯影試劑后，ECL系統(tǒng)顯影成像。使用軟件進(jìn)行灰度分析，β-actin作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1 蟾毒靈對(duì)OVCAR-3細(xì)胞活力的影響 結(jié)果顯示，蟾毒靈處理OVCAR-3細(xì)胞24 h和48 h后能明顯降低其細(xì)胞活力，并且呈劑量依賴性。10 nmol/L蟾毒靈作用24 h后即可降低OVCAR-3細(xì)胞活力，并且隨著時(shí)間或者劑量的增加，對(duì)OVCAR-3細(xì)胞活力的抑制能力越明顯，與未處理的OVCAR-3細(xì)胞相比，100 nmol/L蟾毒靈作用24 h的OVCAR-3細(xì)胞活力約為對(duì)照組的59%。通過(guò)構(gòu)建回歸方程，計(jì)算出蟾毒靈作用OVCAR-3細(xì)胞24 h和48 h后的IC50為(114.6±4.1)nmol/L和(93.2±3.2) nmol/L(圖1)。

A：蟾毒靈刺激24 h后的細(xì)胞活力；B：蟾毒靈刺激48 h后的細(xì)胞活力

2 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析蟾毒靈對(duì)OVCAR-3細(xì)胞凋亡的影響 通過(guò)流式分析技術(shù)，檢測(cè)蟾毒靈對(duì)OVCAR-3細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，蟾毒靈能顯著增加OVCAR-3細(xì)胞的凋亡水平，并且呈劑量依賴效應(yīng)，10 nmol/L蟾毒靈即可顯著增加OVCAR-3的凋亡比例，與對(duì)照組相比，1、10、100 nmol/L蟾毒靈引起的細(xì)胞凋亡百分比為(7.6±1.1)、(17.3±4.3)、(29.8±7.2)(P<0.05)(圖2)。

A：流式細(xì)胞結(jié)果；B：流式結(jié)果分析結(jié)果

3 Western blot檢測(cè)Livin和Caspase-3的蛋白表達(dá)情況 通過(guò)檢測(cè)Livin和Caspase-3的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈能顯著增加Caspase-3的剪切，并降低Livin的表達(dá)。與對(duì)照組相比，1 nmol/L和10 nmol/L即可增加Caspase-3的剪切水平，100 nmol/L蟾毒靈作用24 h后Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平是對(duì)照組的(2.2±0.2)倍(P<0.05)。Livin的Western blot結(jié)果顯示，100 nmol/L的蟾毒靈能顯著降低Livin的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，降低至對(duì)照組的(0.4±0.1)倍(P<0.05)(圖3)。

A：凋亡蛋白條帶；B：灰度分析分析結(jié)果

討 論

隨著近年來(lái)醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，人民預(yù)防意識(shí)的不斷提高，越來(lái)越多的癌癥能夠早期發(fā)現(xiàn)，并得到有效治療[4]。然而，卵巢癌，尤其是上皮癌，由于其癥狀非常不典型，并且病因尚不明確，導(dǎo)致目前采取的預(yù)防措施均不能有效提高卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)時(shí)卵巢癌多處于中晚期，治療效果也相對(duì)有限，因此卵巢癌的治療也成為了研究的重點(diǎn)[5]?；熾m然能有效減少腫瘤細(xì)胞的增殖，但是會(huì)給病人帶來(lái)極大的身體負(fù)擔(dān)，并且卵巢癌的高復(fù)發(fā)性和耐藥性，也增加了治療的風(fēng)險(xiǎn)。

近年來(lái)，我國(guó)科研工作者通過(guò)分析多種傳統(tǒng)中藥的成分，成功分離出了一些具有顯著抗癌作用中藥產(chǎn)物，蟾毒靈就是其中一個(gè)[6]。蟾毒靈是從傳統(tǒng)中藥蟾酥中提取出來(lái)的，其作用廣泛，低劑量的蟾毒靈具有強(qiáng)心，止痛和抗炎的作用，而高劑量的蟾毒靈具有明顯的抗癌作用[7-8]。之前的研究顯示，蟾毒靈對(duì)肝癌，膀胱癌和宮頸癌等都有顯著的抑制作用[9-10]。我們的結(jié)果顯示蟾毒靈能有效抑制人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的細(xì)胞活力，該結(jié)果提示，蟾毒靈在治療人卵巢癌中也會(huì)發(fā)揮明顯的抗癌作用。

為明確蟾毒靈抑制人卵巢癌的細(xì)胞活力的原因，我們通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)分析了，不同濃度蟾毒靈對(duì)OVCAR-3細(xì)胞的凋亡影響。結(jié)果顯示隨著劑量的增加，蟾毒靈作用后能明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果提示蟾毒靈對(duì)OVCAR-3細(xì)胞的抑制作用可能是通過(guò)促進(jìn)其凋亡而發(fā)揮作用的。暴蕾等[11]在2014年發(fā)表的文章中，發(fā)現(xiàn)蟾毒靈對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的抑制作用也是通過(guò)促進(jìn)凋亡水平，該結(jié)論與我們的研究結(jié)果相一致。

Livin蛋白，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的凋亡抑制蛋白，也被稱為BIRC7蛋白，其結(jié)構(gòu)上又有一個(gè)桿狀病毒凋亡抑制蛋重復(fù)序列(Baculovirus IAP repeat，BIR)和RING指環(huán)結(jié)構(gòu)[12]。一般情況下，Livin在體內(nèi)表達(dá)量很低，但是當(dāng)在某些腫瘤中，例如肺癌、前列腺癌和卵巢癌，Livin的表達(dá)量明顯升高[13]。焦伊勝[14]發(fā)現(xiàn)Livin在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，調(diào)控Livin可能是治療卵巢癌的靶點(diǎn)之一。為了確證Livin是否參與了蟾毒靈促進(jìn)卵巢癌的凋亡作用，我們檢測(cè)了加入蟾毒靈后Livin和Caspase-3的表達(dá)情況，結(jié)果提示蟾毒靈能夠顯著抑制OVCAR-3細(xì)胞中Livin的表達(dá)，并促進(jìn)Caspase-3的剪切。以上結(jié)果提示，蟾毒靈抑制卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞活力，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡增加，而這一過(guò)程可能受到Livin蛋白的調(diào)控。