馬元吉， 鄒云增， 葛均波

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200032

作為影響急性心肌梗死(myocardial infarction, MI)發(fā)生和發(fā)展的兩個重要危險因素，高脂血癥和高血壓病具有較強的協(xié)同作用，而氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在這其中起著重要的作用。研究[1]發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)在動脈硬化斑塊及梗死心肌中發(fā)生聚集。而本課題組發(fā)現(xiàn)，ox-LDL[2]和AngⅡ[3]能誘導(dǎo)DCs的成熟。因此，本研究通過體外模擬高脂血癥小鼠心肌梗死(myocardial infarction, MI)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)被激活的內(nèi)環(huán)境，進(jìn)一步研究ox-LDL在AngⅡ的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)DCs成熟、遷移及對其引起的炎癥反應(yīng)的影響，并探討可能參與其中的信號通路。

1 材料與方法

1.1 DCs的培養(yǎng)和分組 將C57BL/6J小鼠處死后，置入75%乙醇中浸泡，剪下雙側(cè)股骨，進(jìn)行骨髓腔沖洗，將得到的骨髓細(xì)胞懸液以1 500 r/min(r=6 cm)離心 10 min，去上清。用1 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，再用200目濾網(wǎng)過濾。取9 mL含有粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)和IL-4的DCs培養(yǎng)基沖洗濾網(wǎng)，得到細(xì)胞懸液10 mL，置于含有5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。換液、半量換液。培養(yǎng)到第6天時，細(xì)胞計數(shù)并接種到六孔板，進(jìn)行藥物干預(yù)，持續(xù)48 h。分組：Medium alone組、AngⅡ(100 nmol/L)組、ox-LDL(50 μg/mL)+AngⅡ組；3組樣品均加入等量的壞死心肌細(xì)胞上清液。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細(xì)胞因子IL-6、TNF-α及IL-10的濃度 取DCs上清液。按照R&D system公司提供的試劑盒進(jìn)行IL-6、TNF-α及IL-10的檢測。用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定光密度(D450)值，計算結(jié)果。

1.3 流式細(xì)胞術(shù) 取100 μL細(xì)胞懸液，參照抗體說明書加流式抗體(anti-CD83, anti-CD86)，避光4℃孵育45 min，PBS緩沖液洗滌；以1 500 r/min(r=6 cm)離心10 min；重復(fù)操作1次；棄上清，再加入400 μL PBS重懸細(xì)胞，上機進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

1.4 細(xì)胞遷移測定(劃痕實驗) 細(xì)胞培養(yǎng)至單層；PBS洗滌，培養(yǎng)基饑餓16 h；用無菌Tip劃出一道劃痕，PBS洗滌2次，去除劃下和未貼壁細(xì)胞，顯微鏡下拍照；加入ox-LDL和(或)AngⅡ，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下成像；計數(shù)遷移至劃痕區(qū)的細(xì)胞[2]。

1.5 壞死心肌細(xì)胞的制備 為了獲得壞死的心肌細(xì)胞，體外模擬心肌梗死的內(nèi)環(huán)境，把HL-1心肌細(xì)胞在液氮冷凍，再37℃解凍，反復(fù)凍融5次。通過胎盤藍(lán)染色觀察壞死細(xì)胞數(shù)量，證實壞死細(xì)胞為90%以上。以3 000 r/min(r=6 cm)離心10 min，收集壞死心肌細(xì)胞上清液待用[3]。

1.6 蛋白免疫印跡法 收集細(xì)胞，抽提蛋白，測定濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。封閉后，將膜置于抗體孵育盒，參照抗體說明書加入合適濃度的一抗，室溫溫育2 h或4℃過夜(>8 h)。洗膜，然后用1∶5 000 HRP標(biāo)記的二抗孵育膜1 h，曝光顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL在AngⅡ基礎(chǔ)上進(jìn)一步增強DCs的遷移 結(jié)果(圖1A)顯示：AngⅡ能夠增強DCs遷移，而ox-LDL可以在AngⅡ基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)DCs的遷移(P<0.05)。

2.2 ox-LDL在AngⅡ基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)DCs免疫成熟標(biāo)志和協(xié)同刺激分子的表達(dá) 結(jié)果(圖1B)表明：AngⅡ能夠促進(jìn)DCs表達(dá)成熟標(biāo)志物CD83和協(xié)同刺激分子CD86；ox-LDL能夠在AngⅡ的基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)CD83、CD86的表達(dá)(P<0.05)，說明高脂內(nèi)環(huán)境較單純的MI內(nèi)環(huán)境能夠進(jìn)一步激發(fā)體內(nèi)的炎癥機制，加重梗死后心肌炎癥反應(yīng)。

2.3 ox-LDL在AngⅡ基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)DCs分泌炎性因子 結(jié)果(圖1C)顯示：ox-LDL能夠在AngⅡ基礎(chǔ)上進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α和IL-6的分泌(P<0.05)，說明高脂狀態(tài)刺激下進(jìn)一步促進(jìn)DCs的炎性因子的釋放，加重炎癥反應(yīng)。

圖1 ox-LDL在AngⅡ基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)DCs遷移能力(A)、成熟(B)和炎癥因子分泌(C)

2.4 ox-LDL+AngⅡ可以誘導(dǎo)DCs激活NF-κB信號通路 結(jié)果(圖2)表明：與單純給予AngⅡ干預(yù)相比，ox-LDL+AngⅡ可以進(jìn)一步誘導(dǎo)IκB和NF-κB磷酸化(P<0.05)。

圖2 ox-LDL和 AngⅡ?qū)F-κB信號通路的影響

*P<0.05 與 Medium alone相比；&P<0.05 與 AngⅡ相比

2.5 ox-LDL+AngⅡ能夠誘導(dǎo)DCs激活Toll樣受體4(TLR4)信號通路 結(jié)果(圖3A)表明：ox-LDL在AngⅡ的基礎(chǔ)上上調(diào)了TLR4和髓樣分化因子88(MyD88)的表達(dá)，同時上調(diào)了TLR4下游分子IRAK-4的磷酸化程度(P<0.05)；ox-LDL對TRIF的表達(dá)影響不大。結(jié)果提示，ox-LDL在AngⅡ的基礎(chǔ)上進(jìn)一步激活TLR4-MyD88-IRAK-4信號通路。

2.6 ox-LDL+AngⅡ能夠誘導(dǎo)DCs表面血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)的表達(dá) 結(jié)果(圖3B)表明：ox-LDL在AngⅡ的基礎(chǔ)上能進(jìn)一步上調(diào)LOX-1受體的表達(dá)(P<0.05)，提示LOX-1可能介入了高脂環(huán)境下DCs的進(jìn)一步免疫成熟和炎癥反應(yīng)。

圖3 ox-LDL+AngⅡ?qū)Cs激活TLR4信號通路及LOX-1表達(dá)的影響

A：ox-LDL和AngⅡ?qū)LR4-Myd88信號通路的影響；B：ox-LDL+AngⅡ誘導(dǎo)LOX-1進(jìn)一步表達(dá).*P<0.05 與 Medium alone相比；&P<0.05 與 AngⅡ相比

3 討 論

ox-LDL具有細(xì)胞毒性，是早期心室重構(gòu)的危險因子，影響心臟結(jié)構(gòu)和功能[4-5]。既往研究證明，ox-LDL在心臟組織中的濃度可能遠(yuǎn)高于其血液濃度，可以在損傷內(nèi)皮后直接作用于心肌細(xì)胞，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥厚[6]。還有研究[7]提示，MI后患者血清ox-LDL抗體水平顯著升高，并與MI患者死亡率正相關(guān)。同樣，MI后外周血液中AngⅡ水平激增[8-9]，同時影響梗死區(qū)和非梗死區(qū)的心肌重構(gòu)。

AngⅡ與ox-LDL之間有密不可分的聯(lián)系[10-11]。AngⅡ和ox-LDL分別可增加冠脈內(nèi)皮細(xì)胞血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的表達(dá)。DCs在動脈硬化斑塊及梗死心肌中發(fā)生聚集，而ox-LDL[2]和AngⅡ[3]能誘導(dǎo)DCs的成熟。LOX-1是攝取和代謝ox-LDL的主要受體[12]。LOX-1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及纖維母細(xì)胞[13]等，而近年研究發(fā)現(xiàn)其在DCs表面也有表達(dá)[14]，參與抗原遞呈過程。

為了揭示高脂環(huán)境下DCs免疫成熟以及炎癥反應(yīng)，本研究通過體外培養(yǎng)C57BL/6J小鼠的骨髓細(xì)胞，采用GM-CSF及IL-4誘導(dǎo)分化DCs。同時，為了模擬小鼠高脂及MI后RAS激活的內(nèi)環(huán)境，本研究利用AngⅡ和ox-LDL干預(yù)DCs觀察其免疫成熟和炎癥反應(yīng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL在AngⅡA基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)DCs免疫成熟和致炎性因子的分泌。

既往研究證實TLR4、NF-κB和LOX-1共同表達(dá)于DCs[14-15]。TLRs在免疫應(yīng)答中可以通過MyD88信號通路和TRIF信號通路進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究[16]顯示，ox-LDL誘導(dǎo)循環(huán)及系統(tǒng)炎癥部分可能通過TLR4途徑實現(xiàn)，這提示TLR4可能在脂質(zhì)分子和炎癥反應(yīng)及MI間扮演著重要角色。既往研究[17]證實，TLR4參與動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)。另外，TLR4表達(dá)上調(diào)還被認(rèn)為與急性冠脈綜合征[18]以及C反應(yīng)蛋白正常的冠心病患者的嚴(yán)重程度正相關(guān)[19]。NF-κB作為一個多向性核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖等。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB與動脈粥樣硬化[20]和冠心病[21]的炎癥反應(yīng)有著密切聯(lián)系。NF-κB不僅能夠介導(dǎo)TLR4下游信號傳導(dǎo)，而且，還能反向上調(diào)TLR4的表達(dá)，兩者之間可能存在正反饋過程[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ和ox-LDL同時干預(yù)時，NF-κB/IκB的磷酸化增強，提示NF-κB通路參與了ox-LDL進(jìn)一步誘導(dǎo)DCs免疫成熟和炎癥反應(yīng)過程。本研究還發(fā)現(xiàn)，ox-LDL+AngⅡ可以誘導(dǎo)DCs中TLR4/MyD88的激活和IRAK-4的磷酸化；而TRIF在ox-LDL+AngⅡ作用下，表達(dá)未明顯增強。IRAK-4的磷酸化是激活NF-κB通路的重要步驟，因此推斷TLR4/MyD88-NF-κB通路參與DCs免疫成熟和炎癥反應(yīng)過程[23]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL在Ang Ⅱ基礎(chǔ)上進(jìn)一步上調(diào)了LOX-1的表達(dá)，同時激活了TLR4/MyD88-NF-κB通路，說明LOX-1和TLR4/MyD88-NF-κB通路均介入了DCs參與高脂血癥合并心肌梗死發(fā)生和發(fā)展的過程。