，， ，

結(jié)核分枝桿菌侵入肺部后，大多患者表現(xiàn)為隱性感染，部分患者感染該菌后會(huì)出現(xiàn)輕重不一的臨床癥狀，這一方面與感染的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量和性狀有關(guān)，一方面與自身的免疫功能有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌，以往的研究與報(bào)道大都與細(xì)胞免疫有關(guān)[1-2]，隨著流式細(xì)胞儀的普及以及免疫細(xì)胞檢測(cè)種類的增加，流式細(xì)胞術(shù)在結(jié)核感染的診斷和療效評(píng)價(jià)方面取得一定的進(jìn)展[3]。我院于2015年引進(jìn)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的FC500型流式細(xì)胞儀，經(jīng)過一年多的使用，現(xiàn)將肺結(jié)核患者免疫細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行總結(jié)，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1病例選擇 676例入選患者為2016.1-2017.5來本院就診的門診和住院肺結(jié)核患者，其中女性191例，男性485例，年齡15-92歲，平均年齡43.0±19.53歲。痰菌陰性的肺結(jié)核患者369例，年齡15-92歲，平均年齡41.6±19.21歲，痰菌陽性的肺結(jié)核患者307例，年齡17-83歲，平均年齡44.30±20.17歲；痰菌陰性與陽性的肺結(jié)核患者相比，年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.78，P=0.08)；初治肺結(jié)核患者569例，復(fù)治肺結(jié)核患者74例，耐多藥肺結(jié)核患者33例，所有患者的診斷均符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]中肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除合并HIV、糖尿病等其他免疫缺陷病患者，以及最近半年有過免疫治療的患者。40例健康對(duì)照者來自本院體檢中心，年齡17-72歲，平均年齡37.25±15.86例，肺結(jié)核患者與健康對(duì)照者相比，年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.83,P=0.07)

1.2研究方法 所有患者入院當(dāng)日抽取靜脈血，經(jīng)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)抗凝后送檢采用貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的FC500型流式細(xì)胞儀進(jìn)行外周血免疫細(xì)胞的檢測(cè)，以熒光微球?yàn)閰⒄掌愤M(jìn)行免疫細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)，試劑為貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的配套試劑，所有檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒配備的說明書和SOP文件操作，每次檢測(cè)以庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的細(xì)胞質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

1.3治療方法 569例初治肺結(jié)核患者中有554例患者采用標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核治療方案2HRZE/4HR 進(jìn)行治療，其中有44例患者在此抗結(jié)核治療的基礎(chǔ)上輔以胸腺法新(海南中和藥業(yè)有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051916，1.6mg/次，2次/周，皮下注射)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療，連續(xù)治療2個(gè)月后再抽取靜脈血檢測(cè)免疫細(xì)胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 PEMS 3.1醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1經(jīng)檢測(cè)肺結(jié)核患者CD4+,CD8+,B,NK細(xì)胞數(shù)量低于健康對(duì)照(t=6.25,5.12,5.05,4.37;P值均為P=0.00)，肺結(jié)核患者與健康對(duì)照者免疫細(xì)胞的檢測(cè)情況見表1。

表1 肺結(jié)核組與健康對(duì)照組免疫細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的比較
Tab.1 Comparison of the absolute number of immune cells in tuberculosis group and healthy group

組別例數(shù)CD4+(個(gè)/μ L)CD8+(個(gè)/μL)B(個(gè)/μL)NK(個(gè)/μL)肺結(jié)核組676535.56±264.92361.66±218.0160.95±117.74253.77±185.31健康對(duì)照組40720.08±175.05528.90±199.80230.91±82.74369.34±160.89t=6.25,P=0.00t=5.12,P=0.00t=5.05,P=0.00t=4.37,P=0.00

2.2痰菌陽性肺結(jié)核患者CD4+,CD8+,B,NK細(xì)胞數(shù)量低于痰菌陰性肺結(jié)核患者(t=4.07,3.70,2.75,2.71;P=0.00,0.00,0.01,0.01)，痰菌陽性與痰菌陰性肺結(jié)核患者免疫細(xì)胞的檢測(cè)情況見表2。

表2 痰菌陽性與痰菌陰性肺結(jié)核患者免疫細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的比較
Tab.2 Comparison of the absolute numbers of immune cells in tuberculosis patients with sputum positive and sputum negative

組別例數(shù)CD4+(個(gè)/μL)CD8+(個(gè)/μL)B(個(gè)/μL)NK(個(gè)/μL)痰菌陽性組307492.11±255.25326.40±221.11148.87±117.95233.70±155.89痰菌陰性組369574.09±265.23388.21±212.56173.72±116.54270.93±200.72t=4.07,P=0.00t=3.70,P=0.00t=2.75,P=0.01t=2.71,P=0.01

2.360歲以上的老年人與30歲以下的年輕人相比，NK細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.89,P=0.06)，CD4+,CD8+,B細(xì)胞數(shù)差異(t=4.04,2.60,5.25；P=0.00,0.01,0.00)；與30-60歲的中年人相比CD4+,B細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.59,3.23；P值均為P=0.00)；CD8+, NK細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.19,1.96;P=0.24,0.06)。30-60歲的中年人與30歲以下的年輕人相比CD8+,B細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.98,3.08;P=0.00,0.04)；CD4+,NK細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.39,0.02;P=0.70,0.98)不同年齡肺結(jié)核患者免疫細(xì)胞的檢測(cè)情況見表3。

表3 不同年齡肺結(jié)核患者免疫細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的比較
Tab.3 Comparison of the absolute numbers of immune cells in tuberculosis patients with different age

年齡(歲)※例數(shù)CD4+(個(gè)/μL)CD8+(個(gè)/μL)B(個(gè)/μL)NK(個(gè)/μL)≤30①260572.84±259.09385.30±173.20190.91±129.22245.20±173.3031-60②254563.73±268.66353.20±194.39160.57±91.51244.85±153.21≥61③162468.58±255.22324.67±263.54123.94±124.22284.84±229.68t=4.04,3.59;P=0.00,0.00t=2.60,1.19;P=0.01,0.24t=5.25,3.23;P=0.00,0.00t=1.89,1.96;P=0.06,0.06

※ 統(tǒng)計(jì)值為③與①②比較值

2.4569例初治肺結(jié)核患者中有554例采用標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核治療方案2HRZE/4HR治療。554例肺結(jié)核患者中有510例僅采用傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核治療，有44例患者在標(biāo)準(zhǔn)化治療方案的基礎(chǔ)上輔以胸腺法新進(jìn)行免疫治療。治療前，標(biāo)準(zhǔn)化治療組與合并免疫治療組相比CD4+、CD8+、B、NK細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.46，2.18，2.73，2.47；P=0.00，0.03，0.01，0.01)。經(jīng)過2個(gè)月的治療后，標(biāo)準(zhǔn)化治療組與合并免疫治療組相比CD4+、CD8+、B、NK細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.89，0.28，0.88，0.61；P=0.37，0.0.78，0.38，0.54)；與自身相比，510例僅采用標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核治療方案的患者CD4+、CD8+、B、NK細(xì)胞數(shù)量增加無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.19，1.04，0.39，1.82；P=0.23，0.30，0.70，0.07)；44例采用標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核治療合并免疫治療的結(jié)核患者除NK細(xì)胞數(shù)量增加無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.80；P=0.42)，CD4+、CD8+、B細(xì)胞數(shù)量明顯增加(t=2.15，2.17，3.12；P=0.03，0.03，0.00)，554例初治肺結(jié)核患者經(jīng)過2個(gè)月的治療后免疫細(xì)胞的變化情況見表4。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌主要通過飛沫經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺泡，侵入肺泡的結(jié)核分枝桿菌被吞噬細(xì)胞吞噬后，通過阻止巨噬細(xì)胞吞噬溶酶體的成熟及酸化、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等方式逃避機(jī)體的免疫殺傷[5]，使得該菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，造成原發(fā)感染；當(dāng)結(jié)核分枝桿菌再次侵入人體，人體的免疫系統(tǒng)受到抗原刺激后，免疫細(xì)胞開始活化，分泌細(xì)胞因子，通過一系列的免疫反應(yīng)清除侵入體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌。表1資料提示肺結(jié)核患者免疫細(xì)胞CD4+、CD8+、B、NK細(xì)胞的表達(dá)水平低于健康對(duì)照者，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌侵入人體后，由于患者免疫細(xì)胞數(shù)量降低，不利于該細(xì)菌的及時(shí)清除，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌在肺內(nèi)長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖，造成不同程度的肺損傷。

表2資料提示痰菌陽性肺結(jié)核患者CD4+、CD8+、B、NK細(xì)胞數(shù)量顯著低于痰菌陰性肺結(jié)核患者。結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌，細(xì)胞免疫對(duì)該菌的清除起主導(dǎo)作用[6]，機(jī)體主要依靠CD4+T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子活化單核吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞通過釋放穿孔素和顆粒酶以及誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡等方式清除侵入體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，研究表明CD4+T細(xì)胞缺乏容易導(dǎo)致早期肺外結(jié)核菌的播散以及肺結(jié)核的快速進(jìn)展[7]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)體液免疫在結(jié)核菌的清除中也起到重要作用[8]，B淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生中和抗體、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、吞噬調(diào)理作用以及抗原提呈作用等方式清除體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌。研究表明，B淋巴細(xì)胞缺乏的小鼠感染結(jié)核分枝桿菌后，肺組織炎癥反應(yīng)加重，B淋巴細(xì)胞可減輕其炎癥反應(yīng)進(jìn)展和增強(qiáng)抑菌作用[9]。NK細(xì)胞可直接殺傷結(jié)核分枝桿菌感染的靶細(xì)胞，無需MHC限制，也可通過ADCC效應(yīng)清除結(jié)核分枝桿菌。研究表明，NK 細(xì)胞在結(jié)核特異性抗原ESAT-6 刺激下可通過分泌高水平的 IFN-γ協(xié)同 CD4+T細(xì)胞在抗結(jié)核感染中發(fā)揮重要作用[10]。因此NK細(xì)胞減少易導(dǎo)致機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除能力減弱，黃麗靜等人認(rèn)為T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的水平變化可以預(yù)測(cè)肺結(jié)核病情的嚴(yán)重程度[11]。

表4 554例肺結(jié)核患者經(jīng)2個(gè)月治療后免疫細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的比較
Tab.4 Comparison of the absolute number of immune cells in 554 patients with pulmonary tuberculosis after 2 months of treatment

組別例數(shù)時(shí)期CD4+(個(gè)/μL)CD8+(個(gè)/μL)B(個(gè)/μL)NK(個(gè)/μL)標(biāo)準(zhǔn)化治療組510治療前455.04±243.45387.17±240.73141.33±103.18271.88±170.05治療后474.55±279.61401.73±205.63138.61±121.32251.55±185.98t=1.19,P=0.23t=1.04,P=0.30t=0.39,P=0.70t=1.82,P=0.07合并免疫治療44治療前322.54±248.39305.93±192.8597.96±69.70206.0±169.50治療后435.68±245.07392.81±182.83155.11±99.46233.82±155.30t=2.15,P=0.03t=2.17,P=0.03t=3.12,P=0.00t=0.80,P=0.42

表3資料提示老年肺結(jié)核患者除NK細(xì)胞外，CD4+,CD8+,B 淋巴細(xì)胞的數(shù)量低于年輕人，與中年人相比，CD4+,B淋巴細(xì)胞數(shù)量也降低，由于免疫細(xì)胞數(shù)量的減少，其分泌的細(xì)胞因子含量也隨之降低，適應(yīng)性免疫功能的下降導(dǎo)致其對(duì)結(jié)核分枝桿菌清除能力減弱。劉會(huì)等人認(rèn)為老年繼發(fā)性肺結(jié)核患者T細(xì)胞免疫功能較中青年患者低，治療效果差，治療時(shí)間長(zhǎng)[12]。對(duì)于老年肺結(jié)核患者在化療的基礎(chǔ)上，進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿庖吒深A(yù)治療能夠提高患者細(xì)胞免疫功能，有利于結(jié)核分枝桿菌的清除[13]。

結(jié)核分枝桿菌侵入人體后，患者的免疫功能受到一定的損傷，尤其是重癥結(jié)核病患者，其細(xì)胞免疫和體液免疫較普通結(jié)核病患者受到的損害更大[14]，耐多藥結(jié)核病患者較敏感患者細(xì)胞免疫功能下降明顯,病情復(fù)雜，治療難度大[15]，表4資料提示對(duì)于免疫細(xì)胞減少的肺結(jié)核患者在標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核治療的基礎(chǔ)上合并使用胸腺法新進(jìn)行免疫治療2個(gè)月后，除NK細(xì)胞增加不明顯外，CD4+、CD8+、B淋巴細(xì)胞數(shù)量均增加。說明聯(lián)合治療可促進(jìn)患者適應(yīng)性免疫功能的恢復(fù)，有利于機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除，有研究表明對(duì)于初治肺結(jié)核患者給予免疫輔助治療，可加快病灶的吸收[16]。

綜上所述，肺結(jié)核患者免疫細(xì)胞的表達(dá)水平降低，痰菌陽性和老年肺結(jié)核患者降低尤為明顯，肺結(jié)核患者在常規(guī)抗結(jié)核藥物治療的基礎(chǔ)上輔以適當(dāng)?shù)拿庖咧委煾欣诨颊叩目祻?fù)。