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登革熱(dengue fever，DF)是由登革病毒(dengue virus，DENV)引起的病毒感染性疾病，主要通過埃及伊蚊和白蚊伊蚊對人類和靈長類動物的叮咬傳播[1]。人類感染登革病毒后臨床癥狀為發(fā)熱、頭痛、全身肌肉骨骼關(guān)節(jié)痛、皮疹等。2009年WHO對登革熱臨床分型分為登革出血熱和重癥登革熱[2]。登革病毒含有3個結(jié)構(gòu)蛋白，即包膜蛋白E，膜蛋白M和衣殼蛋白C，和7個非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[3]。根據(jù)包膜蛋白E的抗原不同，登革病毒分為4個血清型(DENV1-4), 4種DENV血清型均有傳染性和致病性[4]。E蛋白是參與中和及血凝抑制作用的主要抗原，而登革病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1也具有抗原亞組和型特異的抗原表位。NS1是一種可溶性補體結(jié)合抗原，能引起保護(hù)性免疫[5]。

登革熱廣泛流行于熱帶和亞熱帶國家[6]。近年來，我國登革熱也頻發(fā)流行。廣東省深圳市一直是全國登革熱防控的重點地區(qū)，2015年由醫(yī)院送檢排查登革熱疑似病例102份，檢出陽性46份，2016年由醫(yī)院送檢排查登革熱疑似病例327份，檢出陽性24份，4個亞型在深圳市均有檢出，并出現(xiàn)了Ⅲ、Ⅳ型登革病毒。本研究收集2015-2016年深圳市流行的登革熱血清樣本，進(jìn)行分離鑒定，并對登革Ⅲ、Ⅳ型病毒的E基因和NS1基因進(jìn)行分析, 探討其地理遷移和輸入源頭。

1 材料與方法

1.1樣本采集 采樣對象主要是登革熱疑似病例和臨床病例等，有必要時采集疑似病例密切接觸者的樣本，采集5 mL血液標(biāo)本，血清、血漿均可。48 h內(nèi)進(jìn)行病毒分離，可存放于4 ℃-8 ℃；存放時間較長，應(yīng)將血清分離出來，存放于-70 ℃，避免反復(fù)凍融。

1.2樣本來源 樣本為深圳市疾病預(yù)防控制中心病原生物所實驗室保存的2015-2016年登革熱患者的血清。

1.3試劑及儀器 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品，青鏈霉素為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，DMSO為美國Sigma公司產(chǎn)品，C6/36細(xì)胞為深圳市疾病預(yù)防控制中心病原生物所保存，PCR試劑盒和瓊脂糖購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，High Pure Viral RNA kit為德國Roche公司產(chǎn)品，登革病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型核酸檢測試劑盒購自深圳澳東檢驗檢測科技有限公司。

1.4病毒分離培養(yǎng) 患者血清用2%的細(xì)胞維持培養(yǎng)液稀釋20倍并過濾，待C6/36細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞鋪至培養(yǎng)瓶80%～90%時，將稀釋后的血清接種在C6/36細(xì)胞中，28 ℃ 5% CO2培養(yǎng)，每天在鏡下觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)75%的C6/36細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變圓、空泡狀等細(xì)胞病變時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，并與-80 ℃保存。

1.5登革病毒血清型鑒定 取200 μL血清樣本，用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，以提取后的RNA為模板，用登革病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型分型試劑盒進(jìn)行FQ-PCR反應(yīng)，對登革熱樣本進(jìn)行血清型鑒定。

1.6E基因和NS1基因引物設(shè)計 從 GenBank中查找登革病毒的E基因和NS1基因序列(E基因GenBank登錄號：AY099337.1、EF440435.1等，NS1基因GenBank登錄號：JN406515.1、JF262783.1等)，運用Primer Express 3.0軟件，分別設(shè)計登革Ⅲ、Ⅳ型病毒E基因和NS1基因上下游PCR引物(Primer F、Primer R)，詳見表1。

1.7E基因和NS1基因PCR擴(kuò)增 取200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，以提取后的RNA為模板，65 ℃ 5min變性后立即放在冰上，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：5×RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，Primer Mix 0.5 μL，RNA 7 μL。在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA于-20 ℃保存。以登革Ⅲ、Ⅳ型病毒E基因和NS1基因cDNA為模板，PCR擴(kuò)增E基因和NS1基因片段。PCR反應(yīng)體系：5 μL 10×Buffer，4 μL dNTP，1 μL Primer F，1 μL Primer R，0.25 μL Enzyme，3 μL cDNA，35.75 μL H2O。反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min, 30循環(huán)；72 ℃12 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1%的瓊脂糖電泳成像。

表1 登革Ⅲ、Ⅳ型病毒E基因和NS1基因上的引物序列
Tab.1 Sequences of primers for gene E and NS1

基因引物/探針序列5'-3'擴(kuò)增片段(bp)DENV-Ⅲ-E-FATGAGATGTGTGGGAGTAG-GAAACA1 475DENV-Ⅲ-E-RTGCACCACAGCTCCCAGATAGDENV-Ⅲ-NS1-FACATGGGGTGTGTCATA-AATTGG1 016DENV-Ⅲ-NS1-RCTCATTAATGGGTCTA-ATTTCCGCDENV-Ⅳ-E-FGCGATGTGTAGGAGTAGG-GAACAG1 482DENV-Ⅳ-E-RGCTTGAACTGTGAAAC-CTAGAAACAGDENV-Ⅳ-NS1-FTGTCATGGAGTGG-GAAAGAATTG1 043DENV-Ⅳ-NS1-RCACCTGTGATTTGACCATGT-TCTC

1.8E基因和NS1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，用無菌刀片切下特異性目的條帶，膠回收純化DNA，測量純化后的DNA濃度并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板的質(zhì)量，進(jìn)行測序反應(yīng)；測序反應(yīng)后利用96孔板離心機(jī)進(jìn)行純化，去除反應(yīng)產(chǎn)物中的dNTP、ddNTP和鹽，得到DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物后經(jīng)DNA測序儀自動測序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9基因序列的同源性和進(jìn)化分析 利用NCBI BLASTn對GenBank基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索，并從GenBank下載世界上其他地方流行的登革病毒基因序列，用Clustalx進(jìn)行同源性比較，并用MEGA5.0構(gòu)建Neighbor-Joining進(jìn)化樹,模型采用Kimura2-Parame-ter model，Bootstrap值設(shè)定為1000。用DNAMAN5.2.2對NS1序列進(jìn)行翻譯，并分別進(jìn)行DENV 1-4、DENV-3和DENV-4分離株NS1基因的氨基酸序列比對。

2 結(jié) 果

2.1DENV-3和DENV-4分離鑒定及E/NS1基因PCR擴(kuò)增 用C6/36細(xì)胞對8份血清樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)，在接種病毒的第4 d，7份C6/36細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、圓亮、脫落和空泡等病變，見圖1A-B。收集出現(xiàn)病變的C6/36細(xì)胞第4 d的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行分型鑒定，見圖1C-D。結(jié)果顯示，成功分離到5株DENV-3和2株DENV-4，將成功分離的病毒依次命名為：SZ2016/1/DV-3、SZ2016/2/DV-3、SZ2016/3/DV-3、SZ2016/4/DV-3、SZ2016/5/DV-3、SZ2015/6/DV-4、SZ2015/7/DV-4。將成功分離的5份DENV-3病毒和2株DENV-4病毒分別進(jìn)行E基因和NS1基因PCR擴(kuò)增，7份病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳均在1 000-2 000 bp之間出現(xiàn)明顯目的條帶，與預(yù)期片段位置一致，見圖1E-F。經(jīng)測序及序列Blast驗證，7份病毒E基因和NS1基因成功擴(kuò)增。

2.2DENV-3和DENV-4的E基因和NS1序列及其基因進(jìn)化分析 利用NCBI BLASTn對5株DENV-3分離株和2株DENV-4 E基因序列進(jìn)行同源性檢測分析結(jié)果顯示，與DENV-3分離株相似性最高(99%)的毒株主要是印度尼西亞2010和2015年分離株、菲律賓2015年分離株。與DENV-4分離株相似性最高(99%)的毒株主要是菲律賓2013年分離株、印度尼西亞2010分離株、意大利2009年分離株。將5株DENV-3分離株和2株DENV-4的E基因與基因庫中下載的世界其他流行區(qū)分離株的序列相比對，并繪制基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖2。

圖2 登革病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Dengue virus Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ E gene system evolutionary tree analysis

A:未接種DENV的C6/36細(xì)胞；B:接種DENV的C6/36細(xì)胞; C:DENV-3分型鑒定，依次是陽性對照、SZ2016/1/DV-3、SZ2016/2/DV-3、SZ2016/3/DV-3、SZ2016/4/DV-3、SZ2016/5/DV-3；D: DENV-4分型鑒定，依次是陽性對照、SZ2015/6/DV-4、SZ2015/7/DV-4; E:E基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，F(xiàn): NS1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果1:SZ2016/1/DV-3;2:SZ2016/2/DV-3;3:SZ2016/3/DV-3;4:SZ2016/4/DV-3;5:SZ2016/5/DV-3;6:SZ2015/6/DV-4;7:SZ2015/7/DV-4圖1 C6/36細(xì)胞分離鑒定及E/NS1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of DENV were cultured with c6/36 cells and Dengue Ⅲ, Ⅳ virus PCR amplification

DENV1-4 E基因進(jìn)化樹顯示，4種血清型分別在不同的分支上，血清型間核甘酸序列同源性在80%左右，同型血清型間的核苷酸同源性均在90% 以上。DENV-1和DENV-3同在一個大分支上，DENV-2和DENV-4同在一個大分支上。SZ2016/4/DV-3與新加坡2010年分離株SG(EHI)D3/34473Y10、印度尼西亞2009年分離株0907a在同一個分支上；SZ2016/5/DV-3與印度尼西亞2010年分離株1008a、1009a和2013年分離株(080)在同一分支；SZ2016/3/DV-3與印度尼西亞2015年分離株D3/Hu/niid17和WGY-031在同一分支；SZ2016/2/DV-3與深圳DENV-3分離株與菲律賓2015年分離株P(guān)hilippines2015和澳大利亞2006年分離株Townsville在同一個分支。SZ2016/6/DV-4與意大利2015年分離株DENV4-12489和菲律賓2015年分離株DENV4-15983在同一分支；SZ2016/7/DV-4與印度2010年分離株VCRC/DEN4/01/10、斯里蘭卡2012分離株SL2590 G、巴基斯坦2009年分離株0907aTw在同一分支。

DENV 1-4 NS1基因氨基酸序列比對結(jié)果顯示，所選4株不同血清型的病毒株氨基酸相似性為77.69%。4株DENV-3深圳分離株間NS1相似性為92.75%，見圖3、4、5。2株DENV-4深圳分離株間NS1相似性為94.94%。同E基因序列相似，4種血清型間NS1氨基酸相似性比同型血清型間氨基酸相似性小。圖中藍(lán)色顯示的氨基酸序列為不同病毒株的共有序列，4個不同血清型的登革熱NS1抗原存在5-7個氨基酸保守區(qū)域，為高度保守區(qū)。DENV-3和DENV-4 NS1基因氨基酸序列比對結(jié)果顯示，NS1氨基酸序列在同一個血清型間存在個別氨基酸變異。

3 討 論

近幾年來，DENV-1為廣東省主要流行血清型，其次為DENV-2血清型，DENV-3和 DENV-4均為散發(fā)病例[7]，但在2010年秋季，廣東省廣州市發(fā)生了DENV的本地暴發(fā)事件，致病毒株被確定為DENV-4[8]。深圳作為經(jīng)濟(jì)特區(qū)，經(jīng)濟(jì)貿(mào)易頻發(fā)，人口流動大，增加了登革病毒輸入的可能性，且深圳屬于沿海城市，氣候溫暖潮濕，適宜白紋伊蚊和埃及伊蚊的孳生，而且登革病毒還可通過輕癥病例和隱性感染者輸入，一旦病例輸入未能及時發(fā)現(xiàn)并識別，極易造成疫情蔓延[9]。

登革病毒是RNA病毒，基因組易發(fā)生變異。登革病毒基因組全長約10 700核苷酸序列，編碼了3 411個氨基酸。其中E基因含1 485個堿基，編碼495個氨基酸，包含促進(jìn)病毒結(jié)合和進(jìn)入易感細(xì)胞的位點，其突變可能會影響病毒介導(dǎo)的膜融合和病毒毒力，可誘導(dǎo)保護(hù)性中和抗體[10]。也有實驗表明，E蛋白氨基酸序列的改變將增強病毒與單核巨噬細(xì)胞的吸附，進(jìn)而引起登革熱/登革熱出血熱 的發(fā)生[11]。NS1基因含有1 056個堿基，編碼352個氨基酸，具有強烈的免疫原性，在患者感染急性期血液中含量較高[12]，刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度保護(hù)性抗體，在病毒感染過程中具有重要作用。Gong Cheng通過對不同年代寨卡毒株的研究發(fā)現(xiàn)，亞洲系寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1上的一個氨基酸位點發(fā)生了突變，導(dǎo)致NS1蛋白的分泌能力增強，使得病毒可以更高效的感染蚊蟲，進(jìn)而導(dǎo)致蚊蟲的病毒感染率和傳播率大幅上升，這可能是造成寨卡病毒的大范圍流行的原因[13]。NS1蛋白的C末端缺失可能為登革熱疫苗的發(fā)展提供了可能的策略[14]，也可以不同菌株的共有高度保守序列作為抗原表位研制疫苗。因此本研究選擇E基因和NS1基因進(jìn)行序列分析，為下一步研究提供其分子病毒學(xué)特征。

A: 深圳分離株DENV-3 NS1氨基酸序列比對B: 深圳分離株DENV-4 NS1氨基酸序列比對A: The amino acid sequence of DENV-3 NS1 was compared in Shenzhen B: The amino acid sequence of DENV-4 NS1 was compared in Shenzhen圖4 深圳分離株DENV3-4 NS1氨基酸序列比對Fig.4 The amino acid sequence of DENV3-4 NS1 was compared in Shenzhen

E基因序列進(jìn)化樹顯示，深圳DENV-3和 DENV-4分離株均在不同的小分支上，深圳登革病毒3型4型的散發(fā)之間并無直接聯(lián)系。DENV-3和 DENV-4分離株顯示與印度尼西亞、菲律賓、新加坡、斯里蘭卡有較高的同源性，表明深圳登革病毒3型4型很有可能是由輸入性病例引起。深圳分離株DENV-3和 DENV-4的 E基因和NS1基因序列同源性均超過90%，且核苷酸突變具有一定的隨機(jī)性。4個不同血清型的登革熱NS1抗原存在的5-7個氨基酸保守區(qū)域。本研究采用分子流行病學(xué)方法對DENV株的分布和進(jìn)化進(jìn)行監(jiān)測，從登革熱病例中分離出的DENV-3和 DENV-4毒株及其基因組序列數(shù)據(jù)庫將有助于更好了解登革熱的擴(kuò)張和遺傳進(jìn)化，為了解病毒差異、其地方性分布和疫苗開發(fā)提供數(shù)據(jù)[15]。