李姍姍，舒 昀，陳 來，李 俊，陳麗玲，曾文婷，袁可望，舒 坤，徐 彭，羅小泉

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004)

腫瘤研究中，新療法、新藥物并未顯著改善癌癥患者的治療和預(yù)后的一個重要原因是臨床前腫瘤動物模型不能很好地預(yù)測臨床試驗效果。在現(xiàn)有腫瘤動物模型中，腫瘤瘤株與人腫瘤之間不可避免的種屬差異，是導(dǎo)致動物試驗結(jié)果與臨床治療人腫瘤的實際情況相差較遠的根本原因，從這個角度出發(fā)，人腫瘤的異種移植模型無疑是最具有應(yīng)用價值和前景的。而現(xiàn)有成熟的異種移植模型以先天免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的動物作為載體的人源腫瘤模型存在一個重要的先天缺陷：即其搭載動物為免疫缺陷小鼠，在允許異種人腫瘤存活的同時，先天缺失抗腫瘤免疫反應(yīng)，這意味著無法采用該模型研究移植腫瘤與特異性免疫系統(tǒng)的相互作用和評估免疫治療方法及藥物的作用效果[1-2]，限制了近年來活躍的腫瘤免疫治療及其基礎(chǔ)研究。因此，建立既能保留人體腫瘤生物學(xué)特性，又具有正常免疫功能的動物模型是腫瘤研究尤其是腫瘤免疫研究的迫切需要。本研究擬建立可適用于病人來源的，且免疫功能相對正常的人腫瘤異種移植動物模型，從而為腫瘤研究，尤其是腫瘤免疫研究提供新的臨床前研究模型。KM小鼠由于繁殖周期短、多胎妊娠和抵抗力強，是常用的宮內(nèi)移植實驗對象。本文在前期工作的基礎(chǔ)上[3]繼續(xù)探討了妊娠小鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射人腫瘤HepG2細胞對胎鼠成活率和生長發(fā)育的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠，8周齡，體重30 ～ 40 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK (湘) 2013-0004]。雌鼠經(jīng)配種、生產(chǎn)后備用。飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心[SYXK (贛) 2017-0004]。實驗獲得江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理審查證號：JZLLSC2017-0021)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 細胞株

人肝癌HepG2細胞購自上海細胞研究所，由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(批號為922L035)，購自德國默克制藥公司；鹽酸布比卡因(批號為D1102A)，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；通用型中性組織固定液(4%多聚甲醛)(批號為175030)，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(批號為20171108)，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(含雙抗，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)(批號為20170812)，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；胎牛血清(批號為RY3201)，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；胰蛋白酶(批號為T1300)，購自北京索萊寶科技有限公司；臺盼藍染液(批號為20161122)，購自北京索萊寶科技有限公司。拉制儀(型號為PC-1)，購自日本成茂公司；微量注射器(型號為IM-9B)，購自日本成茂公司；恒溫臺(型號為TP-SMZSL)，購自日本東海希多公司；CO2培養(yǎng)箱(型號為C150)，購自德國賓德有限責(zé)任公司；全自動脫水機(型號為HistoCore Pearl)，購自德國徠卡儀器有限公司；包埋機(型號為Arcadia)，購自德國徠卡儀器有限公司；切片機(型號為RM2235)，購自德國徠卡儀器有限公司；染色封片工作站(型號為AutostainerXL + TS5015 + CV5030)，購自德國徠卡儀器有限公司；五人共覽顯微鏡(型號為DM2500B)，購自德國徠卡儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，移入培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱，于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。注射前于倒置顯微鏡下采用臺盼藍染色法計活細胞數(shù)，用PBS調(diào)整細胞懸液至不同濃度：2.5 × 107/mL、5 × 107/mL和7.5 × 107/mL，即時備用。

1.3.2 實驗動物分組、手術(shù)及術(shù)后觀察

選取雄性種鼠和經(jīng)產(chǎn)的雌性種鼠，在交配前分開隔離飼養(yǎng)。下午1∶1合籠，第二天檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)天定為0 d。孕鼠隨機分為5組，于孕14 d開腹腔行子宮內(nèi)注射，即向每只胎鼠腹腔注射10 μL不同濃度的HepG2細胞懸液，對照組注射等量無菌PBS溶液，全部胎鼠注射完成后縫合，假手術(shù)組孕鼠只開腹腔不進行胎鼠腹腔注射，直接縫合。

手術(shù)具體方法如下：孕鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉溶液(70 mg/kg)麻醉，放置在恒溫臺上，仰臥，固定。75%酒精消毒并剃光腹部毛發(fā)。下腹部做1 cm的縱向切口，用濕潤棉簽輕輕舒展筋膜，并將妊娠子宮從切口中牽出，確定左、右卵巢，記錄胎鼠數(shù)量后將子宮放回腹腔。其后逐只牽出進行注射，注射針頭由外徑1 mm的毛細玻璃管拉制，術(shù)中不斷用37°C預(yù)熱生理鹽水濕潤子宮。記錄胎鼠注射可能出現(xiàn)的出血、囊液滲出、囊膜外突、胎鼠損傷等手術(shù)并發(fā)癥。注射完成后，小心抽離注射針，將胎鼠小心放回腹腔。用5-0編織可吸收縫線縫合筋膜，5-0不可吸收縫線縫合皮膚。于切口處皮下注射0.05%鹽酸布比卡因溶液(5 mg/kg)以減少孕鼠痛苦。將孕鼠放置在保溫臺上保持體溫，直至其醒來。醒來后轉(zhuǎn)移至鋪有厚紗布的籠具里，并置于安靜的區(qū)域直到生產(chǎn)。

第二天檢查孕鼠有無陰道出血、腹部收縮或煩躁等流產(chǎn)征兆。其后每天觀察，注意傷口紅腫、發(fā)炎、傷口分離和感染等癥狀。記錄每組孕鼠分娩及胎鼠成活情況。

1.3.3 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠的出生后生長發(fā)育指標(biāo)測定

考察出生后存活的乳鼠發(fā)育狀況，包括觀察是否存在外觀畸形，定期稱重，并記錄耳廓分離、牙萌出、出毛、睜眼時間、張耳、雄性睪丸下降、雌性陰道開口等一般生理發(fā)育和運動發(fā)育、神經(jīng)肌肉發(fā)育、反射和感覺功能等特殊生理發(fā)育指標(biāo)的達標(biāo)時間[4-6]。

選取成年后部分小鼠，摘眼球取血后，解剖觀察肝、肺、腎等主要臟器有無畸形、病變，并取心、肝、肺、腎、胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸，用4%多聚甲醛組織固定液固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，HE染色，顯微觀察各組小鼠主要臟器的病理改變情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)并發(fā)癥

孕鼠中除1只因術(shù)中麻醉過量死亡外，其余孕鼠均未發(fā)現(xiàn)感染跡象，每只孕鼠妊娠胎鼠個數(shù)為2 ～ 18只，孕鼠及胎鼠具體情況見表1。

除假手術(shù)組外，各組均出現(xiàn)出血、囊液滲出、囊膜外突等手術(shù)并發(fā)癥，各組總并發(fā)癥較假手術(shù)組差異均有顯著性(P< 0.01)，2.5 × 105細胞注射組囊液滲出、囊膜外突并發(fā)癥與假手術(shù)組間比較差異有顯著性(P< 0.01)，對照組囊液滲出并發(fā)癥、7.5 × 105細胞注射組囊液滲出、囊膜外突并發(fā)癥與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P< 0.05)。與對照組相比，2.5 × 105細胞注射組和7.5 × 105細胞注射組總并發(fā)癥有所增加，差異有顯著性(P< 0.01)，2.5 × 105細胞注射組囊液滲出、囊膜外突并發(fā)癥與對照組相比差異有顯著性(P< 0.01)，7.5 × 105細胞注射組囊膜外突并發(fā)癥與對照組相比差異有顯著性(P< 0.05)。見表1。

表1 手術(shù)孕鼠、胎鼠情況及各組手術(shù)并發(fā)癥的比較Table 1 Comparison of conditions and complications of pregnant and fetal mice during operation in each group

注：與假手術(shù)組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與對照組比較，△P< 0.05，△△P< 0.01。

Note. Compared with the sham operation group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the control group,△P< 0.05,△△P< 0.01.

2.2 妊娠結(jié)局

因正常KM小鼠生產(chǎn)在孕18 ～ 20 d之間，故將生產(chǎn)天數(shù)少于18 d孕鼠認定為早產(chǎn)孕鼠；術(shù)后觀察有流產(chǎn)跡象且超出孕26 d仍未生產(chǎn)孕鼠認定為流產(chǎn)孕鼠。

各注射組的胚胎丟失率較假手術(shù)組高，差異均有顯著性(P< 0.01)。細胞注射組與對照組相比，胚胎丟失率有所增加，其中7.5 × 105細胞注射組較對照組差異有顯著性(P< 0.05)(見表2)。

2.3 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠的發(fā)育狀況

結(jié)果表明，各細胞注射組順利分娩的胎鼠與假手術(shù)組相比，差異無顯著性。對照組與假手術(shù)組相比，雖差異無顯著性，但體重有所增加(見圖1)。

表2 各組孕鼠妊娠結(jié)局的比較Table 2 Comparison of pregnancy outcomes of mice in each group

注：與假手術(shù)組比較，**P< 0.01；與對照組比較，△P< 0.05。

Note. Compared with the sham operation group,**P< 0.01. Compared with the control group,△P< 0.05.

圖1 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠出生后體質(zhì)量增長情況Figure 1 Body mass of fetal mice with in utero intraperitoneal injection after birth

經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射并順利分娩的胎鼠，出生時無形態(tài)缺陷，新生鼠繼續(xù)發(fā)育至成年，其一般發(fā)育指標(biāo)、特殊發(fā)育指標(biāo)，與假手術(shù)組相比無明顯變化，7.5 × 105細胞注射組胎鼠的耳廓分離、雄性睪丸下降、爬行、聽覺驚愕和空中翻正反射時間較假手術(shù)組有所延長，但差異均無顯著性(見表3、表4)。肉眼和HE染色、鏡下觀察表明所有注射組各主要臟器的發(fā)育正常，未見異常結(jié)構(gòu)及細胞(見圖2 ～ 10)。

表3 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠出生后的一般生理發(fā)育指標(biāo)(出生后天數(shù))Table 3 General physiological functions of fetal mice with in utero intraperitoneal injection after birth (postnatal days)

表4 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠出生后的特殊生理發(fā)育指標(biāo)(出生后天數(shù))Table 4 Specialized physiological functions of fetal mice with in utero intraperitoneal injection after birth (postnatal days)

注：A：假手術(shù)組；B：對照組；C：細胞注射組(2.5 × 105)；D：細胞注射組(5.0 × 105)；E：細胞注射組(7.5 × 105)。下圖同。圖2 各組順利分娩胎鼠成年后心臟病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Note. A: Sham operation group; B: Control group; C: HepG2 cell injection group (2.5 × 105); D: HepG2 cell injection group (5.0 × 105); E: HepG2 cell injection group (7.5 × 105). The same in the following figures.Figure 2 Histopathological observation of heart tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖3 各組順利分娩胎鼠成年后肝臟病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 3 Histopathological observation of liver tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖4 各組順利分娩胎鼠成年后肺臟病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 4 Histopathological observation of lung tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖5 各組順利分娩胎鼠成年后腎臟病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 5 Histopathological observation of kidney tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖6 各組順利分娩胎鼠成年后胃病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 6 Histopathological observation of stomach tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖7 各組順利分娩胎鼠成年后十二指腸病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 7 Histopathological observation of duodenum tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖8 各組順利分娩胎鼠成年后空指腸病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 8 Histopathological observation of jejunum tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖9 各組順利分娩胎鼠成年后回指腸病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 9 Histopathological observation of ileum tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖10 各組順利分娩胎鼠成年后盲指腸病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 10 Histopathological observation of cecum tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

3 討論

1948年，Medawar等[7]通過向一種小鼠子宮內(nèi)注射另一種小鼠的細胞，即在胚胎時期接觸外來抗原，使前者出生后小鼠對后者的排斥反應(yīng)消失，并首次提出“獲得性免疫耐受”概念。這為器官移植領(lǐng)域的研究者打開了大門，讓其看到了具有正常免疫功能的機體接納特定非己抗原特性活體細胞、器官的可能性。其后，對“獲得性免疫耐受”的機制研究表明：在胚胎時期，體內(nèi)已有針對多種抗原的具有免疫活性的淋巴細胞克隆，此時若與某種抗原(包括自身的或人工導(dǎo)入的)相遇，與其對應(yīng)的淋巴細胞克隆即被破壞或抑制，出生后只對胚胎期曾接觸過的抗原形成耐受，而對胚胎時期從未接觸過的抗原仍有免疫應(yīng)答[8]。研究表明，采用子宮內(nèi)注射異體、甚至異種細胞的方法，可誘導(dǎo)免疫耐受[9-10]，并在移植排斥研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[11]。本研究基于此原理，擬通過向孕鼠子宮內(nèi)的胎鼠注射人源細胞，建立免疫功能相對正常的人腫瘤異種移植動物模型，從而為腫瘤研究，尤其是腫瘤免疫研究提供新的臨床前研究模型。

基于上述觀點或假定，本研究需建立KM小鼠子宮內(nèi)注射方法。在注射部位的選擇上，劉英等[12]采用胎鼠腹腔注射成功地建立了人臍血造血干細胞宮內(nèi)移植的小鼠模型，其推測宿主腹腔的間皮細胞可起到支架基質(zhì)作用，并把造血干細胞不斷地輸送到血循環(huán)。據(jù)此，本研究采用了胎鼠腹腔注射，通過前期實驗確定了注射時間為孕14 d，并采用了生育耐受性、適應(yīng)性和經(jīng)驗上都優(yōu)于初產(chǎn)孕鼠的經(jīng)產(chǎn)孕鼠。

因為惡性腫瘤細胞和胚胎組織一樣，呈現(xiàn)旺盛的增殖能力，需先考察注射人腫瘤細胞是否會對胎鼠的發(fā)育產(chǎn)生影響，因此本研究擬先考察注射人腫瘤細胞對胎鼠的發(fā)育的影響?？紤]到其后研究中胎鼠接觸異種抗原細胞的數(shù)量是出生后胎鼠的免疫功能及耐受情況的重要影響因素，本研究設(shè)置了不同濃度的人肝癌HepG2細胞注射組[13-14]，并設(shè)假手術(shù)組及對照組，記錄手術(shù)情況及孕鼠生產(chǎn)情況，以及出生小鼠的體重，并對子代鼠的耳廓分離、上下牙萌出、全身絨毛、睜眼時間、張耳、雄性睪丸下降、雌性陰道開口等一般生理發(fā)育學(xué)指標(biāo)和爬行、前肢懸掛、斷崖回避反射、聽覺驚愕、平面翻正反射、空中翻正反射等特殊生理發(fā)育指標(biāo)進行評價，選取成年小鼠解剖觀察肝、肺、腎等主要臟器有無畸形、病變，并取材進行HE染色，顯微觀察各組小鼠主要臟器的病理改變情況。

實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，孕鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射組的術(shù)中總并發(fā)癥顯著增加；與對照組相比，個別細胞注射組的囊液滲出、囊膜外突并發(fā)癥顯著增加，這可能是導(dǎo)致細胞注射組較對照組胚胎丟失率有所增加的原因之一。各濃度細胞注射組子代鼠的體重和生長發(fā)育指標(biāo)差異無顯著性，肉眼觀察各主要臟器無病變，顯微觀察未見異常結(jié)構(gòu)。其中對照組及部分細胞注射組與假手術(shù)組相比，雖差異無顯著性，但體重有所增加的原因可能是對照組較假手術(shù)組胚胎丟失率高，存活的子代鼠少，哺乳期從母鼠獲得的營養(yǎng)相對較多。

在本實驗確定孕鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射人腫瘤HepG2細胞對胎鼠發(fā)育影響的基礎(chǔ)上，后續(xù)實驗還將系統(tǒng)考察子宮注射人源細胞的數(shù)量及時間對順利出生胎鼠的荷瘤能力和免疫系統(tǒng)功能的影響，以確定胚胎期經(jīng)人源腫瘤細胞誘導(dǎo)特異性免疫耐受的小鼠，是否具備正常免疫力，且獨能允許胚胎時期接觸過的腫瘤細胞生長。

在孕鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射后出現(xiàn)的流產(chǎn)等非正常生產(chǎn)受操作技術(shù)影響較大，術(shù)中操作不當(dāng)、過度壓迫胚胎、子宮復(fù)位不好壓迫供血血管、孕鼠術(shù)后疼痛不適和各種原因造成的手術(shù)時間過長均會導(dǎo)致手術(shù)成功率及胎鼠存活率的下降。為減少并發(fā)癥的發(fā)生，提高手術(shù)成功率，本課題組總結(jié)經(jīng)驗，采取了以下措施：①相較于子宮內(nèi)胎鼠注射現(xiàn)普遍采用的微量注射器，本研究用小直徑(1 mm)玻璃毛細管拉制極細的針頭，使進針損傷降至最低。②手術(shù)中對胚胎進行操作時要格外注意，如固定胚胎時注意捉持力度，在保證準(zhǔn)確進針的前提下盡可能輕柔；胚胎放回腹腔時用預(yù)熱生理鹽水濕潤，減少對胚胎的擠壓。③術(shù)后注射鎮(zhèn)痛藥，減少孕鼠的疼痛，緩解不適，保證術(shù)后的保暖和護理措施到位。整個手術(shù)過程嚴格無菌操作，以及不斷練習(xí)提高和熟練實驗操作技術(shù)也是降低流產(chǎn)、早產(chǎn)的發(fā)生，提高手術(shù)成功率的重要保證。

通過以上實驗，本課題組確認了孕鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射人腫瘤HepG2細胞不會對胎鼠發(fā)育產(chǎn)生影響，同時提高了子宮內(nèi)注射操作的技術(shù)水平，為后續(xù)繼續(xù)研究模型小鼠的荷瘤情況和免疫功能打下了基礎(chǔ)。