莫頌軼，張麗鳳，黃彥峰，余雙全，廖素嬋，黃永毅，梁祚仁，黎 昀，蔣敏麗，黃俊杰

(右江民族醫(yī)學(xué)院應(yīng)用生理研究室，廣西 百色 533000)

由于鋁在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人類(lèi)在日常生活中接觸鋁制品的日益增多，鋁可被攝取、吸收并在全身組織器官中分布[1-2]。鋁是一種慢性神經(jīng)毒性物質(zhì)，腦是鋁的蓄積部位和主要靶器官，鋁可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織產(chǎn)生神經(jīng)行為毒性作用，神經(jīng)細(xì)胞對(duì)于鋁的毒性十分敏感，長(zhǎng)期鋁暴露可導(dǎo)致人的認(rèn)知能力和智力下降[3-4]。鋁暴露所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)損害已成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，然而慢性鋁中毒如何影響學(xué)習(xí)和記憶的機(jī)制尚未完全闡明，造成了慢性鋁中毒防治的困難。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立慢性鋁中毒小鼠動(dòng)物模型，測(cè)試小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，以及測(cè)定大腦皮層乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)含量、β-內(nèi)啡肽(β-endorphin，β-EP)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，研究慢性鋁中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響與大腦皮層ACh、β-EP、SOD和MDA的關(guān)系，探討鋁中毒小鼠導(dǎo)致認(rèn)知能力障礙的機(jī)制，為慢性鋁中毒的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)KM小鼠32只，雌雄各半，3月齡，小鼠體重20 ～ 22 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院提供[SCXK (桂) 2017-0003]。小鼠飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK (桂) 2017-0004]，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度為40% ～ 60%，自由進(jìn)水。小鼠的組織取材于右江民族醫(yī)學(xué)院應(yīng)用生理研究室進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

三氯化鋁(AlCl3)(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；小鼠β-內(nèi)啡肽試劑盒購(gòu)于Sigma公司；SOD試劑盒、MDA試劑盒、ACh試劑盒和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。UV-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)SH-2可調(diào)高速勻漿機(jī)(江蘇省金壇市宏華儀器廠)，Y型迷宮刺激器(MG-B，張家港市教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組和鋁中毒模型建立[5-6]

32只KM小鼠，隨機(jī)分為四組，分別是正常對(duì)照組、低劑量鋁中毒組、中劑量鋁中毒組、高劑量鋁中毒組，每組均為8只小鼠，各組小鼠雌雄各半，雌雄分籠飼養(yǎng)。正常對(duì)照組普通飼料飼養(yǎng)三個(gè)月；各劑量鋁中毒組均用16 g/L濃度的AlCl3水溶液拌入飼料中喂養(yǎng)小鼠，低劑量鋁中毒組每天按1.2 mg/kg體重劑量、中劑量鋁中毒組每天按12 mg/kg體重劑量、高劑量鋁中毒組每天按120 mg/kg體重劑量喂養(yǎng)小鼠，每天先喂完拌有AlCl3的飼料后再喂普通飼料，保證各組鋁的攝入量，各劑量鋁中毒組連續(xù)攝入鋁三個(gè)月。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全制度及相關(guān)規(guī)章。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.3.2 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試

各組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶行為能力用Y型迷宮刺激器進(jìn)行檢測(cè)。按文獻(xiàn)[7-8]的實(shí)驗(yàn)方法和學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，將小鼠達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)所需的測(cè)試次數(shù)，作為大鼠學(xué)習(xí)行為能力的檢測(cè)指標(biāo)。學(xué)習(xí)能力檢測(cè)24 h后，依照上述方法對(duì)小鼠連續(xù)進(jìn)行20次測(cè)試，記錄小鼠在20次測(cè)試中的錯(cuò)誤次數(shù)，作為小鼠記憶行為能力的檢測(cè)指標(biāo)。

1.3.3 小鼠大腦皮層ACh、β-EP、SOD和MDA含量測(cè)定

各組小鼠在三個(gè)月后斷頭處死取出腦組織，快速剝離出大腦皮層，用生理鹽水制作成10%的勻漿，取勻漿的上清液分別測(cè)定大腦皮層中ACh含量、β-EP含量、SOD活性和MDA含量，各指標(biāo)的測(cè)試步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 慢性鋁中毒小鼠學(xué)習(xí)和記憶測(cè)試結(jié)果

單因素方差分析顯示，各組間小鼠學(xué)習(xí)測(cè)試次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)差異均有顯著性(分別為F=18.96，P< 0.01；F=25.99，P< 0.01)。中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠學(xué)習(xí)測(cè)試次數(shù)比對(duì)照組均明顯增多，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠學(xué)習(xí)測(cè)試次數(shù)比低劑量組也明顯增多；低劑量、中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠記憶錯(cuò)誤次數(shù)比對(duì)照組均明顯增多，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠記憶錯(cuò)誤次數(shù)比低劑量組也明顯增多；差異均有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 慢性鋁中毒小鼠學(xué)習(xí)和記憶測(cè)試結(jié)果Table 1 Learning and memory abilities of mice with chronic aluminum toxicities

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與低劑量組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the low-dose group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.2 慢性鋁中毒小鼠大腦皮層中ACh和β-EP含量

單因素方差分析顯示，各組間小鼠大腦皮層ACh和β-EP含量差異均有顯著性(分別為F=10.05，P< 0.01；F=6.53，P< 0.01)。中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層ACh含量比對(duì)照組明顯降低，高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層ACh含量比低劑量組也明顯降低；低、中、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層β-EP含量比對(duì)照組明顯降低，高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層β-EP含量比低劑量組明顯降低；差異均有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 慢性鋁中毒小鼠大腦皮層中ACh和β-EP含量測(cè)定結(jié)果Table 2 ACh and β-EP levels in the cerebral cortex of mice with chronic aluminum toxicities

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與低劑量組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the low-dose group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.3 慢性鋁中毒小鼠大腦皮層中SOD活性和MDA含量的測(cè)定結(jié)果

單因素方差分析顯示，各組間大腦皮層SOD活性和MDA含量差異均有顯著性(分別為F=10.60，P< 0.01；F=7.16，P=0.01)。與對(duì)照組相比較，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層SOD活性均明顯降低，而中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層MDA含量均升高，差異均有顯著性(P< 0.01或P< 0.05)；與低劑量組相比較，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層SOD活性均降低，而高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層MDA含量升高，差異有顯著性(P< 0.01或P< 0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 慢性鋁中毒小鼠大腦皮層中SOD活性和MDA含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 SOD and MDA levels in the cerebral cortex of mice with chronic aluminum toxicities

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與低劑量組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the low-dose group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.4 慢性鋁中毒小鼠學(xué)習(xí)和記憶與大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)及自由基的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層中ACh、β-EP和SOD均與相應(yīng)同劑量組學(xué)習(xí)測(cè)試次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均呈負(fù)相關(guān)(P< 0.05或P< 0.01)；高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層中MDA含量與同劑量組學(xué)習(xí)測(cè)試次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均呈正相關(guān)(P< 0.05或P< 0.01)。詳見(jiàn)表4。

表4 慢性鋁中毒小鼠學(xué)習(xí)和記憶與大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)及自由基的相關(guān)性分析(n=8)Table 4 Correlation analysis between learning and memory abilities and the levels of ACh, β-EP, SOD, and MDA in the cerebral cortex of mice with chronic aluminum toxicities

3 討論

學(xué)習(xí)與記憶是兩個(gè)有聯(lián)系的神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程，是動(dòng)物和人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高級(jí)功能活動(dòng)。迄今為止，有關(guān)學(xué)習(xí)和記憶的機(jī)制仍不十分清楚。已有研究表明，學(xué)習(xí)和記憶力與神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿密切相關(guān)[9-12]，腦內(nèi)乙酰膽堿有促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶的作用；阿片肽是神經(jīng)肽的主要成員，內(nèi)啡肽屬于阿片肽中的一族，內(nèi)啡肽中主要是β-內(nèi)啡肽，有研究報(bào)道，β-內(nèi)啡肽可易化記憶[13 -14]，其作用與給藥劑量和給藥時(shí)間呈明顯相關(guān)性，但也有人認(rèn)為β-內(nèi)啡肽可損害記憶能力[15]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各劑量鋁中毒組小鼠學(xué)習(xí)訓(xùn)練次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均高于正常對(duì)照組，且學(xué)習(xí)訓(xùn)練次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)增多的幅度隨著鋁中毒劑量的增高而增多，這說(shuō)明慢性鋁中毒可致小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道[4, 16]一致。本研究結(jié)果還顯示，各劑量鋁中毒組小鼠學(xué)習(xí)測(cè)試次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)增加的同時(shí)，其大腦皮層乙酰膽堿和β-內(nèi)啡肽的含量反而明顯低于對(duì)照組，且小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，大腦皮層乙酰膽堿和β-內(nèi)啡肽也隨之明顯降低，呈現(xiàn)了一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；通過(guò)Pearson相關(guān)性分析顯示，中、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層中乙酰膽堿和β-內(nèi)啡肽均與相應(yīng)同劑量組學(xué)習(xí)測(cè)試次數(shù)、記憶錯(cuò)誤次數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，這說(shuō)明大腦皮層中乙酰膽堿和β-內(nèi)啡肽參與學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)遞質(zhì)，大腦皮層中乙酰膽堿和β-內(nèi)啡肽均有促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]一致。

超氧化物歧化酶(SOD)是一種能夠催化超氧化物通過(guò)歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫的酶，在保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的毒害中發(fā)揮著重要作用；自由基攻擊膜脂中的不飽和脂肪酸，使其發(fā)生氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)就會(huì)升高。本研究結(jié)果表明，中、高劑量鋁中毒組大腦皮層SOD活性均明顯降低，而中、高劑量鋁中毒組大腦皮層MDA含量均升高；高劑量組小鼠大腦皮層中SOD與學(xué)習(xí)測(cè)試次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均呈負(fù)相關(guān)；而MDA含量與學(xué)習(xí)測(cè)試次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)呈正相關(guān)。慢性鋁中毒使鋁在體內(nèi)腦、骨、肝等多個(gè)組織器官中蓄積，特別鋁可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織產(chǎn)生神經(jīng)行為毒性作用[17-18]。進(jìn)入腦組織內(nèi)的鋁可引起大腦皮層脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)和產(chǎn)生自由基增多[19-20]，氧自由基引起的DNA損傷可激活p53基因，氧自由基的氧化應(yīng)激可活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和Caspase基因家族等途徑，可加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此，鋁中毒后導(dǎo)致小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加，從而使小鼠學(xué)習(xí)記憶受到損傷[21-22]。

綜上所述，不同劑量鋁中毒可引起小鼠認(rèn)知功能障礙，鋁中毒可能通過(guò)降低大腦皮層中乙酰膽堿、β-內(nèi)啡肽和SOD含量，升高M(jìn)DA含量，進(jìn)而影響小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力，這可能是鋁中毒致小鼠認(rèn)知能力障礙的機(jī)制之一。但其具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究和探討。