胡喜貴， 吳曉軍， 姜小苓， 王玉泉， 李 淦， 胡鐵柱， 茹振鋼

(河南省現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心/河南科技學(xué)院小麥研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

DOF(DNA-binding with one finger)蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用[1]。DOF蛋白一般由200～400個(gè)氨基酸組成，包括2個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：N-端DNA結(jié)合高度保守結(jié)合域(DOF Domain)和C-端轉(zhuǎn)錄調(diào)控域[2]。醇溶蛋白盒結(jié)合因子(prolamin-box binding factor，PBF)屬于DOF蛋白家族之一，是胚乳組織特異的基因表達(dá)調(diào)控因子，主要調(diào)控作物籽粒中貯藏蛋白基因表達(dá)，最終影響貯藏蛋白的積累量[3]。目前已在玉米、水稻、大麥等禾本科作物中，廣泛開展了PBF基因調(diào)控功能研究[4-6]。Mena等利用大麥PBF基因同源性，首次克隆出小麥PBF編碼基因[5]。該基因被定位于普通小麥(TriticumaestivumL.，AABBDD，2n=6x=42)第5號(hào)同源群(5A、5B和5D)的著絲粒附近，并在小麥胚乳的整個(gè)發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)[7]。

普通小麥?zhǔn)钱愒炊啾扼w物種的一個(gè)典型代表，其A、B和D染色體組分別由烏拉爾圖小麥(TriticumurartuTum. AA，2n=2x=14)、擬斯卑尓脫山羊草(AegilopsspeltoidesTausch. SS，2n=2x=14)和節(jié)節(jié)麥(AegilopsTauschiiCoss. DD，2n=2x=14)提供[8-12]。由于異源多倍化以及長(zhǎng)期馴化的過程，現(xiàn)代普通小麥的遺傳多樣性較其祖先種大大降低[13]。Ravel等對(duì)27個(gè)普通小麥研究證實(shí)，普通小麥的PBF等位基因(wPBF-A、wPBF-B和wPBF-D)多樣性較低[14]。因此，發(fā)掘普通小麥祖先種PBF基因的種質(zhì)資源，將對(duì)小麥品質(zhì)改良具有重要意義。截至目前，節(jié)節(jié)麥PBF基因已有報(bào)道[15]，但其他2個(gè)祖先種的PBF基因尚未見報(bào)道。本研究擬對(duì)2份烏拉爾圖小麥材料進(jìn)行PBF基因克隆并分析其序列結(jié)構(gòu)特征，以期為進(jìn)一步研究烏拉爾圖小麥PBF基因調(diào)控功能、改良普通小麥品質(zhì)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)2份烏拉爾圖小麥材料(TriticumurartuTum.)PI428225(土耳其)和PI428269(黎巴嫩)，均由美國(guó)種質(zhì)資源庫(kù)(National Genetic Resources Program，NPGS)饋贈(zèng)，經(jīng)河南科技學(xué)院小麥中心繁殖并保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中烏拉爾圖小麥G1812的全基因組鳥槍法測(cè)序數(shù)據(jù)(登錄號(hào)：KD091395)，設(shè)計(jì)1對(duì)覆蓋PBF基因完整編碼區(qū)的特異性引物：PBF-F(5′-ATTCGATATGTGT-GTACACATGT-3′)和PBF-R(5′-TCTTGCACTTACATCA-GGGAG-3′)，其引物由Thermo Fisher Scientific InvitrogenTM公司合成。

1.3 基因克隆與測(cè)序

2份烏拉爾圖小麥材料進(jìn)行室溫發(fā)苗，培養(yǎng)7 d左右，取幼嫩葉片備用。參照Yan等的2×CTAB方法[16]，提取基因組總DNA。采用高保真TransStart?Fast Pfu DNA聚合物(TransGen Biotech，中國(guó)北京)進(jìn)行PBF基因擴(kuò)增。其PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖進(jìn)行電泳分離，切取目的條帶，經(jīng)PUEX Gel DNA回收試劑盒(Bioche，中國(guó)北京)純化，與pEASY克隆載體(pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit，TransGen Biotech，中國(guó)北京)連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、挑取3個(gè)陽性克隆，送華大基因公司(BGI，中國(guó)深圳)測(cè)序。

1.4 序列分析

經(jīng)測(cè)序分析，獲得烏拉尓圖小麥PBF基因DNA序列。利用NCBI的Blastn工具進(jìn)行在線序列比對(duì)，判斷其屬性。同時(shí)，搜索與其同源的核苷酸及氨基酸序列。利用DNAMAN(Ver.7.0)進(jìn)行多序列比對(duì)處理，DNASP(Ver.5.10.01)分析序列的多態(tài)性位點(diǎn)；利用NLStradamus(http：//www.moseslab. csb.utoronto.ca/NLStradamus/)和MyHits (http：//myhits.Isb-sib.ch/)分別進(jìn)行蛋白核定位信號(hào)和翻譯后修飾位點(diǎn)在線預(yù)測(cè)。運(yùn)用MEGA Ver 4.0中的鄰接法(neighbor joining method，NJ)構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏拉爾圖小麥PBF基因克隆

利用設(shè)計(jì)引物PBF-F和PBF-R對(duì)2份烏拉爾圖小麥PI428225和PI428269的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，2份材料均擴(kuò)增出長(zhǎng)度為 1 000 bp 左右的單一條帶(圖1)。將目的片段回收、純化，連接到pEASY克隆載體上，經(jīng)測(cè)序分析后，2份材料的條帶核苷酸序列長(zhǎng)993 bp，對(duì)應(yīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為MF547409(PI428225)和MF547410(PI428269)。

2.2 烏拉爾圖小麥PBF基因核酸序列比對(duì)分析

利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)，表明，本研究克隆烏拉爾圖小麥得到2個(gè)PBF基因的核苷酸序列(MF547409和MF547410)，與已報(bào)道烏拉爾圖小麥(EMS61761)、節(jié)節(jié)麥(KJ544771和KJ544772)和普通小麥中國(guó)春(KC849701、KC849702和KC849703)的PBF基因具有相同的長(zhǎng)度(993 bp)，一致性高達(dá)97.35%。但是，相比不同來源PBF基因序列分析發(fā)現(xiàn)，烏拉爾圖小麥PBF存在豐富變異位點(diǎn)，高達(dá)45個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)(圖2)。在45個(gè)SNPs中，30個(gè)轉(zhuǎn)換(transitions)位點(diǎn)包括18個(gè)G←→A(90、312、423、441、444、462、463、489、504、648、708、718、768、827、857、883、926、951)和12個(gè)C←→T(271、313、392、502、513、578、614、654、687、735、861、888)，15個(gè)顛換(transversions)位點(diǎn)包括3個(gè)T←→A(14、573、590)、3個(gè)T←→G(64、635、800)和9個(gè)C←→G(68、285、336、366、713、794、891、911、980)。

對(duì)烏拉爾圖小麥3個(gè)PBF基因的核苷酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)，共存在6個(gè)突變位點(diǎn)。其中，已報(bào)道的EMS61761序列中有4個(gè)位點(diǎn)，分別是第59、第249位點(diǎn)的C→T、第393位點(diǎn)A→T、第514位點(diǎn)G→A；本研究的MF547410序列中僅存在2個(gè)位點(diǎn)，是第825、第938位點(diǎn)的C→T?？梢姡瑸趵瓲枅D小麥的PBF基因是相對(duì)保守的。

2.3 烏拉爾圖小麥PBF基因氨基酸序列比對(duì)分析

對(duì)根據(jù)烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥和普通小麥中國(guó)春的PBF基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，它們具有相同長(zhǎng)度330個(gè)氨基酸(aa)，并具有相似的結(jié)構(gòu)特征，均含有蛋白核定位信號(hào)保守序列KKPR(NLS core)，N-端保守的DOF結(jié)構(gòu)域(DOF domain)，C-端可變的調(diào)控區(qū)域具有典型的富天冬酰胺(asparagine-rich)序列特征，以及連接N-端結(jié)構(gòu)域和 C-端調(diào)控域的絲氨酸殘基鏈(ser hinge)(圖3)。但相比節(jié)節(jié)麥、普通小麥中國(guó)春的PBF氨基酸序列，烏拉爾圖小麥PBF氨基酸序列發(fā)現(xiàn)22個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(圖3)，主要?dú)w因于核苷酸序列上堿基的替換(轉(zhuǎn)換和顛換)(圖2)。其中，7個(gè)變異位點(diǎn)(5、22、23、91、95、105、131)分布于N-端DOF結(jié)構(gòu)域之外；15個(gè)變異(155、193、197、205、212、238、240、265、267、276、286、295、304、309、327)分布于C-端調(diào)控區(qū)域。

MyHits分析PBF氨基酸序列，共存在3種類型的修飾位點(diǎn)，其中，N-端糖基化位點(diǎn)(ASN-glycosylation site)均有4個(gè)，1個(gè)位于N-端保守的DOF結(jié)構(gòu)域，其余3個(gè)集中分布于C-端調(diào)控區(qū)域末端；酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(CK2-phospho-site)均有5～6個(gè)，分布于整條PBF氨基酸序列上；蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(PKC-phospho-site)均有2個(gè)，分別位于N-端保守的DOF結(jié)構(gòu)域和C-端富天冬酰胺區(qū)域。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，烏拉爾圖小麥PBF氨基酸序列存在特有1個(gè)酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(CK2-phospho-site)，該位點(diǎn)因第22、第23位點(diǎn)2個(gè)氨基酸變異(A→S和G→A)形成，這一特征顯著區(qū)別其他來源序列(圖3)。

2.4 聚類分析

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中有17個(gè)PBF序列：普通小麥中國(guó)春，KC849701、KC849702和KC849703；節(jié)節(jié)麥，KJ544771和KJ544772；烏拉爾圖小麥，EMS61761；黑麥(Secalecereale)，KJ747373～KJ747377；大麥(Hordeumvulgare)，AJ000991和AK375168；玉米(Zeamays)，BT035326和BT062957；水稻(Oryzasativa)，AF480496和CM000127和本研究的2個(gè)烏拉爾圖小麥PBF序列構(gòu)建的聚類樹(圖4)，19個(gè)PBF序列被清晰地分成2組(GroupⅠ和Group Ⅱ)。在第1組(Group Ⅰ)中，15個(gè)PBF序列被進(jìn)一步分為3個(gè)亞組，即來源于大麥PBF亞組、來源于黑麥PBF亞組、來源于普通小麥及供體祖先種(節(jié)節(jié)麥和烏拉爾圖小麥)PBF亞組。

3 討論與結(jié)論

Ravelc等對(duì)27個(gè)普通小麥PBF基因研究發(fā)現(xiàn)，wPBF-A、wPBF-B、wPBF-D等位基因分別存在1、5、1個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)，其結(jié)果表明普通小麥中PBF基因遺傳多樣性較低[14]。本研究從2份烏拉爾圖小麥材料克隆出PBF基因(MF547409和MF547410)核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中烏拉爾圖小麥PBF基因序列(EMS61761)具有較高一致性，僅存在6個(gè)突變位點(diǎn)。然而，相比節(jié)節(jié)麥和普通小麥中國(guó)春PBF基因， 烏拉爾圖小麥PBF存在豐富變異位點(diǎn)，高達(dá)45個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)(圖2)，表明烏拉爾圖小麥PBF基因具有較高遺傳多樣性。聚類分析顯示，來源于烏拉爾圖小麥與普通小麥的PBF聚在1個(gè)亞組(圖4)，證實(shí)了二者親緣關(guān)系較近[10]。同時(shí)，又進(jìn)一步印證了PBF蛋白在物種間存差異且親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，其差異越大，即PBF蛋白表現(xiàn)為種屬特異性[15]。

DOF是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，典型的DOF蛋白由200～400個(gè)氨基酸組成，其N-端有高度保守的DOF結(jié)構(gòu)域和C-端轉(zhuǎn)錄調(diào)控域[1-2]。DOF蛋白能夠特異地識(shí)別并結(jié)合真核生物基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，如CCN4-like(GLM)、醇溶蛋白盒(prolamin box，PB)、5′-AACA/TA-3′基序等，從而激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄[17]。DOF結(jié)構(gòu)域外的氨基酸對(duì)識(shí)別能力沒有影響，但核心序列之外的側(cè)翼序列對(duì)DOF蛋白與DNA結(jié)合特性有一定的影響[18]。C-端轉(zhuǎn)錄調(diào)控域可接受不同信號(hào)途徑的調(diào)控，與不同類型調(diào)控蛋白相互作用激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄[1]?？梢?，DOF蛋白中氨基酸序列變異可導(dǎo)致其功能多樣性。已有研究表明，普通小麥wPBF與小麥醇溶蛋白、麥谷蛋白中的順式作用元件PB特異結(jié)合，參與這2類貯藏蛋白基因的表達(dá)調(diào)控[19-20]。本研究推導(dǎo)的烏拉爾圖小麥PBF蛋白與來源節(jié)節(jié)麥、普通小麥中國(guó)春PBF蛋白序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，所有PBF蛋白均具有DOF典型結(jié)構(gòu)特征。然而，烏拉爾圖小麥PBF蛋白序列存在22個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)：7個(gè)位于N-端DOF結(jié)構(gòu)域之外和15個(gè)位于C-端調(diào)控區(qū)域，其中2個(gè)氨基酸變異(第22位點(diǎn)，A→S；第23位點(diǎn)，G→A)形成了烏拉爾圖小麥特有酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)。這些氨基酸變異位點(diǎn)可能對(duì)烏拉爾圖小麥PBF蛋白的調(diào)控功能產(chǎn)生影響，仍須進(jìn)一步功能研究證實(shí)。綜上所述，本研究為進(jìn)一步研究烏拉爾圖小麥PBF基因的相關(guān)特性、后續(xù)特異標(biāo)記開發(fā)、功能分析等奠定基礎(chǔ)。