王慶云， 王會(huì)英， 趙 琳， 郭希萍

(安陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 河南 安陽(yáng) 455000)

鴨疫里默菌(Riemerellaanatipestifer,R.anatipestifer)是革蘭陰性桿狀菌，屬于黃桿菌屬rRNA超家族V，可感染多種家養(yǎng)和野生水禽，傳播快、病情重、死亡率高，是全球禽類(lèi)疾病防治工作者共同關(guān)注的重大疾病之一。鴨疫里默菌病常見(jiàn)臨床表現(xiàn)為精神委靡、縮頸垂翅、腹瀉、頭頸震顫，病理可見(jiàn)纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎。5周齡以下雛鴨通常在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)1～2 d后死亡，周齡較長(zhǎng)者疾病慢性化和局限化的可能性較高。但幸存鴨遺留生長(zhǎng)緩慢、體重輕等后遺癥，失去飼養(yǎng)價(jià)值。

截至目前，全球已發(fā)現(xiàn)20種鴨疫里默菌血清型，導(dǎo)致了同種疾病在不同地區(qū)的不同疫情特點(diǎn)。因此，對(duì)于該病的防治，首要任務(wù)就是摸清該病在局部地區(qū)的流行病學(xué)特點(diǎn)以及當(dāng)?shù)亓餍芯甑难逍秃涂顾幮浴?/p>

本試驗(yàn)旨在探究河南省安陽(yáng)地區(qū)鴨疫里默菌病的危害情況和發(fā)生規(guī)律，確定當(dāng)?shù)亓餍兄甑难逍秃涂顾幮裕瑸榘碴?yáng)地區(qū)的鴨疫里默菌病的防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源與收集 于2014年1月至2016年1月，在安陽(yáng)地區(qū)文峰、北關(guān)等8個(gè)縣市進(jìn)行了大規(guī)模的鴨疫里默菌病流行病學(xué)調(diào)查。本研究收檢54個(gè)鴨場(chǎng)中發(fā)生漿膜炎病變的死鴨或同群病鴨，共計(jì)117羽，并逐一進(jìn)行尸體剖檢，無(wú)菌采取腦、肝病料進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2 病原分離與鑒定 取無(wú)菌采取腦和肝病料，接種環(huán)取樣劃線(xiàn)接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，于燭缸中37 ℃培養(yǎng)48 h。觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況，挑取只在巧克力瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)、不在麥康凱培養(yǎng)基生長(zhǎng)的圓形光滑、半透明、稍凸起菌落，再次進(jìn)行巧克力培養(yǎng)基純培養(yǎng)，對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。同時(shí)挑取在巧克力瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上均有生長(zhǎng)的紅色小菌落，進(jìn)一步純培養(yǎng)并鑒定。

1.3 細(xì)菌染色與鏡檢 挑取2次純培養(yǎng)后的菌落，涂片，革蘭染色鏡檢。

1.4 細(xì)菌生化試驗(yàn) 對(duì)分離出的二次培養(yǎng)純培養(yǎng)物進(jìn)行生化檢驗(yàn)，于37 ℃孵箱培養(yǎng)72 h。檢驗(yàn)項(xiàng)目包括糖類(lèi)(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、菊糖)、醇類(lèi)(山梨醇、甘露醇、肌醇)、明膠、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽和吲哚試驗(yàn)。每日觀(guān)察并記錄結(jié)果。

1.5 PCR試驗(yàn) 樣本DNA提取采用SDS-Protein K法，經(jīng)紫外分光光度計(jì)計(jì)算核酸含量后稀釋至0.1μg/μL，進(jìn)行R.anatipestifer核酸PCR檢測(cè)。分離菌株的質(zhì)粒抽提及PCR擴(kuò)增采用Tsai等報(bào)道的方法[3]。采用菌株RA0511進(jìn)行氯霉素抗性決定因素分析和質(zhì)粒測(cè)序。針對(duì)鴨疫里默菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物，上下游引物序列分別為：5′-ATGAAAAATTTCTTCGAA-3′， 5′-TCATTTCATTTTTCTAAA-3′。PCR反應(yīng)體系包含1X超高溫耐熱DNA聚合酶反應(yīng)Buffer，50 μmol/μL dNTP，上、下游引物各400 μmol/μL，0.25 U超高溫耐熱DNA聚合酶。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性40 s共35個(gè)循環(huán)，42 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，最終72 ℃延伸7 min。采用PTC-100可編程PCR儀。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(80 V，60 min)，采用溴化乙錠染色，紫外照射，分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 血清型鑒定 采用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)鑒定，將待鑒定的細(xì)菌分離菌株與R.anatipestifer的單因子血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，鑒定其血清型[1]。

1.7 藥敏試驗(yàn) 取53株分離的R.anatipestifer菌株進(jìn)行16種抗生素的藥敏試驗(yàn)。藥物反應(yīng)為不敏感、低敏、中敏、高敏，抑菌圈直徑分別為：0～0.5 mm，0.5～14 mm，15～20 mm，≥20 mm。

1.8 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 取60羽未接種疫苗的15日齡北京鴨雛鴨(購(gòu)自安陽(yáng)市某鴨苗孵育廠(chǎng))，隨機(jī)分為4組，每組15只。試驗(yàn)組分別接種本研究病料中分離的R.anatipestifer菌株單獨(dú)腹腔注射、大腸桿菌(E.coli)、單獨(dú)腹腔注射、R.anatipestifer和E.coli混合腹腔注射(0.5 mL/羽，菌液濃度25×1012CFU/mL)。對(duì)照采用生理鹽水腹腔注射(0.5 mL/羽)。相同條件、分開(kāi)飼養(yǎng)30 d，觀(guān)察并記錄患病情況和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離株來(lái)源情況及數(shù)量 采集文峰、北關(guān)、殷都等8個(gè)縣市共54個(gè)鴨場(chǎng)發(fā)生傳染性漿膜炎的死鴨和/或同群病鴨共117羽。從病料中分離出只在巧克力瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)、不在麥康凱培養(yǎng)基生長(zhǎng)的R.anatipestifer菌株共53株，分離出在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的E.coli菌株共24株，各地病原流行分布情況見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌分離株來(lái)源情況及數(shù)量

2.2R.anatipestifer分離菌株的生化反應(yīng)結(jié)果 所有R.anatipestifer菌株(53株)均可分解鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(53/53,100%)和精氨酸雙水解酶(53/53,100%)。53株RA菌中有49株(92.5%)可液化明膠。所有R.anatipestifer菌株均不能發(fā)酵糖類(lèi)，硝酸鹽還原試驗(yàn)也均為陰性(見(jiàn)表2)。R.anatipestifer分離菌株的生化反應(yīng)結(jié)果基本符合R.anatipestifer特征。

表2 R.anatipestifer分離菌株的生化反應(yīng)結(jié)果

2.3R.anatipestifer分離菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增，分離出的共計(jì)53株R.anatipestifer菌株均可擴(kuò)增出目的條帶；同方法、同條件PCR擴(kuò)增后，分離出的共計(jì)24株E.coli菌株均未產(chǎn)生目的條帶(見(jiàn)表3)。R.anatipestifer菌株擴(kuò)增后的目的條帶為654 bp，見(jiàn)圖1。

表3 分離菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果

圖1 PCR方法檢測(cè)R.anatipestifer分離株及對(duì)照菌株

M：Marker； 1-9：R.anatipestifer； E：E.coli

2.4R.anatipestifer菌株血清型鑒定結(jié)果 分離得到的53株RA菌株血清型鑒定結(jié)果均符合RA血清1型，24株E.coli菌株血清鑒定結(jié)果均為陰性反應(yīng)。

2.5R.anatipestifer分離菌株的耐藥性分析 53株R.anatipestifer菌株中，絕大多數(shù)對(duì)氯霉素(51/53)、呋喃妥因(46/53)、慶大霉素(42/53)耐藥，超半數(shù)菌株對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥(29/53)。超半數(shù)菌株對(duì)青霉素(42/53)、諾氟沙星(42/53) 、氨芐青霉素(39/53)中敏。超半數(shù)菌株對(duì)頭孢氨芐(43/53)、頭孢拉定(38/53)和四環(huán)素(36/53)高敏。

2.6 雛鴨分離菌致病性試驗(yàn)結(jié)果R.anatipestifer菌液?jiǎn)为?dú)注射組雛鴨發(fā)病率為86.7%，死亡率為73.3%；E.coli菌液?jiǎn)为?dú)注射組雛鴨發(fā)病率為73.3%，死亡率為60.0%；R.anatipestifer+E.coli混合菌液注射組雛鴨發(fā)病率為100.0%，死亡率為86.6%。三組病鴨/死鴨剖檢均可見(jiàn)心包炎、肝周炎和氣囊炎的典型“三炎”病變。生理鹽水注射對(duì)照組發(fā)病率和死亡率均為0%。

表4 R.anatipestifer菌株耐藥性分析

-：不敏感；+：低敏；++：中敏； +++：高敏

表5 15日齡雛鴨接種分離菌后死亡情況

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)河南省安陽(yáng)地區(qū)8個(gè)縣市的鴨疫里默菌病進(jìn)行了大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)54個(gè)鴨場(chǎng)進(jìn)行了收集采樣，采集得病/死鴨共計(jì)117羽，分離得到R.anatipestifer菌株共計(jì)53株，分離率達(dá)45.3%。對(duì)分離得到的所有菌株進(jìn)行生化檢驗(yàn)表明，菌株符合R.anatipestifer特征。通過(guò)本試驗(yàn)可見(jiàn)，鴨疫里默菌病是安陽(yáng)地區(qū)的重要流行病，對(duì)該病的防治工作不容忽視。

截止目前，全球范圍內(nèi)報(bào)道的R.anatipestifer血清型共計(jì)20種。以往我國(guó)其他地域的鴨疫里默菌流行株調(diào)查研究顯示，北京地區(qū)逐漸出現(xiàn)8個(gè)以上血清型、江蘇地區(qū)出現(xiàn)5個(gè)以上血清型的鴨疫里默菌。[2]不同血清型菌株的防治各有不同，因此對(duì)局部地區(qū)菌株血清型的監(jiān)測(cè)十分重要。在本研究發(fā)現(xiàn)，安陽(yáng)地區(qū)流行的鴨疫里默菌血清型均為1型，為本地區(qū)鴨疫里默菌病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究對(duì)53株菌株進(jìn)行了包含青霉素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的16種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)安陽(yáng)地區(qū)流行株對(duì)四環(huán)素、頭孢氨芐和頭孢拉定高度敏感；對(duì)氯霉素、呋喃妥因、紅霉素和慶大霉素耐藥。該研究結(jié)果對(duì)本地區(qū)鴨疫里默菌病的治療有重要指導(dǎo)作用。

從本地分離菌株的雛鴨致病試驗(yàn)可知，本地鴨疫里默菌菌株的致病力強(qiáng)，死亡率高；且與大腸桿菌的混合致病也很常見(jiàn)，致病力和死亡率均高于鴨疫里默菌單菌種致病。因此，鴨禽養(yǎng)殖戶(hù)需要加強(qiáng)鴨舍墊料清潔，改善鴨舍環(huán)境，預(yù)防鴨疫里默菌病。