孫潤(rùn)紅, 徐俊蕾, 楊麗榮, 張 潔, 夏明聰, 武 超, 薛保國(guó)*, 吳 坤

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 河南省農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)部華北南部農(nóng)作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南省作物保護(hù)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450002; 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院, 鄭州 450002)

小麥為禾本科植物,是世界上分布最廣泛的糧食作物,我國(guó)主要產(chǎn)于華北及東北地區(qū)。病害問(wèn)題一直是影響小麥產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素,小麥病害的防治是小麥生產(chǎn)的重中之重,也是提高小麥產(chǎn)量的重要途徑。化學(xué)藥劑長(zhǎng)期使用或使用不當(dāng)易導(dǎo)致病原菌抗藥性、環(huán)境污染及農(nóng)藥殘留等問(wèn)題。近年來(lái),生物防治由于其安全、低毒等特點(diǎn)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。拮抗細(xì)菌在植物病害防治中起到了非常重要的作用,無(wú)論是在自然發(fā)生的生物拮抗現(xiàn)象還是在生物防治中,細(xì)菌的生防效果都非常明顯[1]。在眾多的生防細(xì)菌中,枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis憑借其易培養(yǎng)、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、對(duì)人畜無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)而受到青睞[2-3]。植物對(duì)病害及其他逆境的抗性與多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等多種酶的活性變化有關(guān)[4-6]。大量研究表明,生防菌可以誘導(dǎo)這些植物抗病相關(guān)防御酶產(chǎn)生變化,增強(qiáng)抗病能力[7]。易龍等研究發(fā)現(xiàn),芽胞桿菌Bn-130菌液可誘導(dǎo)辣椒體內(nèi)POD、PPO和PAL活性增高[8]。周林等采用灌根法接種枯草芽胞桿菌TR21發(fā)酵液、菌體及發(fā)酵上清液后,香蕉根系內(nèi)POD、PPO和PAL活性均高于空白對(duì)照[9]。林陳強(qiáng)等發(fā)現(xiàn),枯草芽胞桿菌CS16發(fā)酵液及上清液處理香蕉苗均能誘導(dǎo)香蕉葉片中SOD、PPO、PAL和POD等防御酶活性變化[10]。目前,國(guó)內(nèi)生防菌對(duì)小麥抗病防御反應(yīng)酶影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道,為此本研究選擇PAL、POD、SOD、PPO、CAT作為抗病性反應(yīng)指標(biāo),研究了生防菌YB-05對(duì)小麥植株抗病相關(guān)酶的影響,以明確YB-05對(duì)抗病防御酶的誘導(dǎo)機(jī)制,為小麥生產(chǎn)中合理利用YB-05防治小麥真菌病害和深入研究YB-05的生防機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生防菌枯草芽胞桿菌BacillussubtilisYB-05為本實(shí)驗(yàn)室分離得到,現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC02NO.6498。

小麥全蝕病菌Gaeumannomycesgraminisvar.triticiGGT007為本實(shí)驗(yàn)室從小麥根部分離得到,并在本實(shí)驗(yàn)室保存。

小麥品種:供試小麥品種為‘鄭麥366’。

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為PDA和PDB培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的制備及接種

將YB-05菌株在PDA平板中劃線(xiàn)活化,27℃下恒溫培養(yǎng)24 h,得到活化的YB-05菌株單菌落,然后挑取單菌落接種于PDB培養(yǎng)基中,27℃,125 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h即得YB-05種子液,調(diào)節(jié)菌液濃度至106cfu/mL的菌懸液,備用。

1.2.2 小麥的催芽與誘導(dǎo)處理

挑選大小一致的小麥種子,首先用75%乙醇處理5 s,滅菌水沖洗3次,0.1%升汞消毒9 min,再用無(wú)菌水沖洗5次,然后將經(jīng)消毒處理的小麥種子平鋪于直徑12 cm無(wú)菌平皿中,加入5 mL無(wú)菌水, 放置于室溫。1 d后將露白的小麥種子轉(zhuǎn)移至另一個(gè)鋪有無(wú)菌濾紙的平皿中(直徑12 cm),每皿放置約50粒種子,加入10 mL無(wú)菌水,放置于室溫。2 d后,將根長(zhǎng)2～3 cm的發(fā)芽小麥轉(zhuǎn)移至滅菌組培瓶,處理組分別為每瓶接種5株小麥和5 mL 106cfu/mL YB-05菌懸液、5株小麥和5 mL GGT007菌懸液(0.5 g GGT007菌絲溶于5 mL PDB培養(yǎng)基中)、5株小麥和5 mL YB-05和 GGT007混合懸液(0.5 g GGT007菌絲溶于5 mL YB-05菌懸液中),對(duì)照組為5株小麥和5 mL PDB培養(yǎng)基。

分別于處理后24、48、72、96、120 h取小麥幼葉和小麥根提取粗酶液,檢測(cè)不同時(shí)間小麥體內(nèi)相關(guān)防御酶的活性變化。

1.2.3 誘導(dǎo)抗性測(cè)定

分別取0.1 g 葉片和根部用于提取粗酶,PAL、POD、SOD、PPO、CAT等酶活均按照酶活性試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)步驟,利用可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)與誘導(dǎo)植物抗病性密切相關(guān)的防御酶活性(PAL、PPO、SOD、POD、CAT)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 YB-05發(fā)酵液對(duì)小麥葉片和根部苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響

由圖1可知,經(jīng)YB-05發(fā)酵液誘導(dǎo)后,各濃度處理組的小麥葉片和根部PAL活性均高于對(duì)照處理組?？瞻讓?duì)照組小麥葉片和根部的PAL活性最低,在試驗(yàn)期間無(wú)明顯變化。Y+G處理組小麥葉片中PAL活性明顯高于其他3組處理,并在處理后的96 h達(dá)到峰值,為46.705 U/g,為對(duì)照組的1.74倍,與對(duì)照組差異顯著。Y處理組小麥葉片的PAL活性在72 h時(shí)達(dá)到峰值,為35.195 U/g,為對(duì)照組的1.65倍,與對(duì)照組差異顯著。G處理組小麥葉片的PAL活性在試驗(yàn)期間也有顯著變化,在48 h酶活性達(dá)到峰值,為39.325 U/g,為對(duì)照組的1.41倍,與對(duì)照組差異顯著。Y+G處理組小麥根部中PAL活性明顯高于其他3組處理,并在處理后72 h達(dá)到峰值131.536 U/g,為對(duì)照組的1.65倍,與對(duì)照組差異顯著。Y和G處理組小麥根部的PAL活性均在96 h時(shí)達(dá)到峰值,為112.324 U/g和102.576 U/g,分別為對(duì)照組的1.33、1.21倍,與對(duì)照組差異顯著。因此,YB-05發(fā)酵液和全蝕病菌均能誘導(dǎo)小麥葉片和根部中PAL的活性增強(qiáng),且YB-05發(fā)酵液和全蝕病菌共同處理的活性高于單獨(dú)處理,可見(jiàn)YB-05發(fā)酵液和全蝕病菌共同誘導(dǎo)對(duì)PAL具有協(xié)同增效作用。

圖1 生防芽胞桿菌YB-05及全蝕病菌GGT007對(duì)小麥PAL活性的影響Fig.1 Effects of Bacillus subtilis YB-05 and wheat take-all GGT007 on PAL activity in wheat

2.2 YB-05發(fā)酵液對(duì)小麥葉片和根部過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響

生防菌及病原菌共同處理后小麥葉片和根部CAT活性如圖2所示。Y+G處理組小麥葉片CAT活性在試驗(yàn)期間均高于其他3組處理,且在72 h達(dá)到峰值,為1 259.565 U/g,為對(duì)照組的2.42倍。G處理組中小麥葉片的CAT活性在96 h達(dá)到峰值,為784.102 U/g,為對(duì)照組的1.33倍。Y處理組小麥葉片CAT活性變化規(guī)律與Y+G處理組一樣,在72 h達(dá)到峰值,為974.094和1 259.565 U/g,為對(duì)照組的1.87和2.42倍。3組處理CAT活性均高于空白對(duì)照,且Y+G同時(shí)處理的小麥葉片CAT活性比單獨(dú)Y或G處理的小麥葉片CAT活性高。沒(méi)有進(jìn)行任何處理的對(duì)照組小麥葉片CAT活性在120 h內(nèi)變化不大。Y+G處理組、Y處理組以及G處理組小麥根部CAT活性在96 h分別達(dá)到206.241、184.518、173.46 U/g峰值，與對(duì)照組相比CAT活性顯著增高,峰值分別是對(duì)照組的1.74、1.56、1.46倍,與對(duì)照組差異顯著。對(duì)照組小麥根部CAT活性變化范圍不大。比較4個(gè)處理組CAT活性變化,結(jié)果顯示,Y+G處理組小麥葉片和根部的酶活性均顯著高于其他3個(gè)處理組,誘導(dǎo)效果最佳。

圖2 生防芽胞桿菌YB-05及全蝕病菌GGT007對(duì)小麥CAT活性的影響Fig.2 Effects of Bacillus subtilis YB-05 and wheat take-all GGT007 on CAT activity in wheat

2.3 YB-05發(fā)酵液對(duì)小麥葉片和根部過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響

枯草芽胞桿菌YB-05和小麥全蝕病菌誘導(dǎo)小麥葉片POD活性變化見(jiàn)圖3,由圖可知,Y+G處理組、Y處理組以及G處理組小麥葉片POD活性在第48 h分別達(dá)到16 829.274、13 785.902 5、11 653.265 U/g峰值,與對(duì)照組相比POD活性顯著增高,峰值是對(duì)照組的2倍左右。Y+G處理組、G處理組的小麥根部POD活性在72 h時(shí)分別達(dá)到峰值56 424.79、52 715.86 U/g,Y處理組在24 h達(dá)到峰值48 555.945 U/g是對(duì)照組的1.52、1.42、1.7倍,差異顯著。試驗(yàn)期間對(duì)照組小麥葉片和根部POD差異不大。同時(shí)接種生防菌YB-05和病原菌GGT007的小麥葉片和根部的POD活性比單獨(dú)接種生防菌YB-05或病原菌GGT007的POD活性高。說(shuō)明同時(shí)添加YB-05發(fā)酵液和小麥全蝕病菌GGT007對(duì)小麥葉片和根部POD活性顯著高于其他3個(gè)處理組,誘導(dǎo)效果最佳。

圖3 生防芽胞桿菌YB-05及全蝕病菌GGT007對(duì)小麥POD活性的影響Fig.3 Effects of Bacillus subtilis YB-05 and wheat take-all GGT007 on POD activity in wheat

2.4 YB-05發(fā)酵液對(duì)小麥葉片內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

SOD活性檢測(cè)結(jié)果(圖4)所示,Y+G處理組小麥葉片SOD活性呈下降趨勢(shì),且在誘導(dǎo)后24 h達(dá)到峰值104.687 U/g,為對(duì)照組的2.27倍。Y處理組、G處理組小麥葉片SOD活性均在96 h達(dá)到峰值,分別為對(duì)照組的1.63倍和1.91倍,達(dá)到73.52、86.32 U/g,與對(duì)照組差異顯著; Y+G處理組小麥根部SOD活性在試驗(yàn)期間均高于其他3組處理,且在72 h達(dá)到高峰,峰值為1 977.04 U/g。Y處理組小麥根部SOD活性變化規(guī)律與Y+G處理組一致,在72 h達(dá)到峰值,為1 493.43 U/g。G處理組中小麥根部的SOD活性在96 h達(dá)到峰值,為1 246.89 U/g。3個(gè)處理組Y、G和 Y+G處理小麥根部SOD活性均高于對(duì)照,且Y+G同時(shí)處理SOD活性比單獨(dú)Y或G處理的SOD活性高。沒(méi)有進(jìn)行任何處理的對(duì)照組無(wú)論根或葉的SOD活性在120 h內(nèi)變化不大。

2.5 YB-05發(fā)酵液對(duì)小麥葉片內(nèi)多酚氧化酶(PPO)活性的影響

枯草芽胞桿菌YB-05和小麥全蝕病菌對(duì)小麥葉片和根部PPO活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。Y+G處理組的小麥葉片PPO活性在96 h時(shí)達(dá)到峰值97.44 U/g,是對(duì)照組的2.4倍,差異極顯著。Y處理組、G處理組小麥葉片的PPO活性均為先增高后降低的趨勢(shì),均在72 h達(dá)到峰值84.2、72.58 U/g,分別為對(duì)照的1.96倍、1.69倍,與對(duì)照組差異顯著。Y+G處理組小麥根部PPO活性明顯高于其他3組處理,并在處理后的72 h達(dá)到峰值22.564 U/g,為對(duì)照組的2.07倍,差異顯著。Y處理組和G處理組的PPO活性與Y+G處理組變化趨勢(shì)一致,均在72 h時(shí)達(dá)到峰值17.786 U/g和14.265 U/g,分別為對(duì)照組的1.63、1.31倍,與對(duì)照組差異顯著。結(jié)果顯示YB-05發(fā)酵液和全蝕病菌GGT007均能誘導(dǎo)小麥葉片和根部PPO活性增強(qiáng),且兩者共同處理的活性高于單獨(dú)處理,可見(jiàn)枯草芽胞桿菌YB-05發(fā)酵液和全蝕病菌共同誘導(dǎo)對(duì)PPO具有協(xié)同增效作用。

圖4 生防芽胞桿菌YB-05及全蝕病菌GGT007對(duì)小麥SOD活性的影響Fig.4 Effects of Bacillus subtilis YB-05 and wheat take-all GGT007 on SOD activity in wheat

圖5 生防芽胞桿菌YB-05及全蝕病菌GGT007對(duì)小麥PPO活性的影響Fig.5 Effects of Bacillus subtilis YB-05 and wheat take-all GGT007 on PPO activity in wheat

3 結(jié)論與討論

當(dāng)植物受病原菌侵染或誘導(dǎo)處理后,與抗病反應(yīng)相關(guān)的保護(hù)性酶活性升高是誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生的重要機(jī)制之一,其中CAT、SOD、POD、PAL和PPO是植物體內(nèi)與抵制病原微生物侵染有關(guān)的重要酶,其活性的變化通常作為衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)的重要指標(biāo)[11]。

在本試驗(yàn)中,施用生防菌YB-05和接種小麥全蝕病菌后,利用可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)與誘導(dǎo)植物抗病性密切相關(guān)的防御酶活性(PAL、PPO、SOD、POD、CAT)變化。結(jié)果顯示,小麥經(jīng)生防菌與病原菌混合處理、病原菌處理、生防菌處理后,葉片和根部與植物防御抗病相關(guān)的PPO、POD、SOD、PAL、CAT防御酶活性均比對(duì)照組高,說(shuō)明無(wú)論接種生防菌或小麥全蝕病菌,都能刺激小麥體內(nèi)防御酶活性的增加,從而達(dá)到抵御病害侵染的效應(yīng),增強(qiáng)其抗病性。其中生防菌與病原菌混合處理后抗性相關(guān)酶活最高,葉片中PAL、POD、SOD、PPO、CAT酶活峰值分別在96、48、24、96和72 h達(dá)到46.705、16 829.274、104.687、97.44和1 259.565 U/g,為對(duì)照組的1.74、2.44、2.27、2.40和2.42倍。根部PAL、POD、SOD、PPO、CAT酶活峰值分別在72、72、72、72和96 h分別達(dá)到131.536、56 424.79、1 977.04、22.564和206.241 U/g,為對(duì)照組的1.65、1.52、2.57、2.07、1.74倍。表明枯草芽胞桿菌YB-05和小麥全蝕病菌均能誘導(dǎo)小麥葉片和根部的防御酶活性增強(qiáng),兩者共同處理后小麥葉片和根部5種防御酶活性均高于單獨(dú)處理,說(shuō)明枯草芽胞桿菌YB-05和小麥全蝕病菌GGT007共同誘導(dǎo)具有協(xié)同增效作用。

目前防治小麥全蝕病菌主要以化學(xué)防治為主,但長(zhǎng)期大量使用化學(xué)藥劑使得抗藥性不斷增強(qiáng),農(nóng)藥殘留易造成食品安全問(wèn)題,同時(shí)會(huì)加劇環(huán)境污染。生物農(nóng)藥以其對(duì)人畜及生態(tài)環(huán)境無(wú)害的特點(diǎn)越來(lái)越受到人們的關(guān)注,而天然生防微生物以其獨(dú)特的作用機(jī)理一躍成為生物農(nóng)藥發(fā)展熱點(diǎn)?？莶菅堪麠U菌YB-05是河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所通過(guò)對(duì)其16S rDNA基因序列的分析發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)小麥全蝕病菌具有顯著抑制作用的菌株,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)抗性可能是枯草芽胞桿菌YB-05防治小麥真菌病害的重要機(jī)制之一。但對(duì)其發(fā)酵液在田間的防病效果還有待評(píng)價(jià)。因此,后續(xù)的研究有必要通過(guò)大田試驗(yàn)以明確其抗病潛能,驗(yàn)證其抗性誘導(dǎo)機(jī)理,為實(shí)現(xiàn)該菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支持。