姚海霞王 娟王立梅齊 斌

(1. 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

竹豆(bamboo bean)為豇豆屬，又稱飯豆、爬豆等。其資源豐富、種植地廣，目前全國各地，云南、吉林、山西、貴州等均有種植。竹豆?fàn)I養(yǎng)豐富，其富含淀粉、蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵及粗纖維、類胡蘿卜素、VB1、VB2、VC等[1-2]。與綠豆、小豆相比，竹豆具有抗蟲害、產(chǎn)量高、適應(yīng)力強(qiáng)等優(yōu)勢[3]，適合在高溫干旱或土壤貧瘠地區(qū)種植。然而，它卻只被當(dāng)作飼料和綠肥，其種子資源未被有效開發(fā)和利用。

目前，國內(nèi)外對竹豆的農(nóng)藝性狀[4]、栽培措施[5]、種質(zhì)資源多樣性[6]等均有報(bào)道，但關(guān)于竹豆清蛋白的研究報(bào)道幾乎沒有。植物清蛋白的研究大多集中在蕓豆[7]、綠豆[8]11-48、米糠[9]、菜籽粕[10]等農(nóng)作物，研究表明植物清蛋白具有較好的起泡性及乳化性，可部分替代動物雞蛋蛋白，在食品應(yīng)用上具有較大潛力，可應(yīng)用于蛋糕、面包、冰淇淋或者餅干等食品[11-12]，具有來源廣、成本低的優(yōu)勢。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)蛋白亞基對功能性質(zhì)具有重要作用[13-14]，在凝膠性和乳化性方面的研究已較為廣泛[15-16]。本試驗(yàn)擬以竹豆為原材料，采用Osborne分級法[17]提取清蛋白，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，進(jìn)一步分析其亞基組成，以期為研究竹豆清蛋白的理化性質(zhì)及功能性質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

竹豆：購于云南昆明蘭姐特產(chǎn)店；

乙醇、硼酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉：分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；

甲基紅、亞甲基藍(lán)、溴甲酚綠：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

Tris[三(羥甲基)胺基甲烷]、SDS(十二烷基硫酸鈉)、Glycine(甘氨酸)：分析純，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力加熱攪拌器：RCT basic型，蘇州賽恩斯儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：CR22GⅡ型，日本Hitachi公司；

冷凍干燥機(jī)：freezone 6 型，美國Labeonco公司；

pH計(jì)：FE20型，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

電子天平：MP10001型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

超純水儀：Milli-Q advantage型，美國Millipore公司；

電泳儀：Mini-PROTEAN Tetra型，美國Bio-Rad公司；

凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD型，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 竹豆基本成分的測定 竹豆水分、灰分、蛋白、脂肪、淀粉的測定分別按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》中直接干燥法(GB 5009.3—2016)、質(zhì)量法(GB 5009.4—2016)、凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)、索氏提取法(GB 5009.6—2016)和酸水解法(GB 5009.9—2016)進(jìn)行測定。

1.3.2 竹豆清蛋白制備工藝流程

竹豆→粉碎機(jī)粉碎→過篩(60目)→石油醚室溫脫脂[料液比為1∶3 (g/mL)]48 h→自然風(fēng)干→脫脂竹豆→蒸餾水提取→離心(10 000 r/min,4 ℃，15 min)→取上清→調(diào)pH至4.0→離心(10 000r/min,4 ℃，15 min)→取沉淀→水洗→調(diào)至pH至7.0→冷凍干燥48 h→竹豆清蛋白

1.3.3 竹豆清蛋白等電點(diǎn)的測定 配置1 mg/mL竹豆清蛋白溶液，分別將pH調(diào)至3.0～5.6，每0.2一個梯度，靜置1 h后離心取上清，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，分別計(jì)算其溶解度，溶解度最低的pH即為等電點(diǎn)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)提取

(1) 攪拌速率：固定料液比1∶8 (g/mL)、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間1 h，設(shè)置攪拌速率為200，400，600，800，1 000 r/min，考察攪拌速率對竹豆清蛋白提取率的影響。

(2) 攪拌溫度：固定料液比1∶8 (g/mL)、攪拌速率600 r/min、提取時(shí)間1 h，設(shè)置提取溫度為35，40，45，50，55 ℃，考察攪拌溫度對竹豆清蛋白提取率的影響。

(3) 攪拌時(shí)間：固定料液比1∶8 (g/mL)、提取溫度45 ℃、攪拌速率600 r/min，設(shè)置提取時(shí)間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，考察攪拌時(shí)間對竹豆清蛋白提取率的影響。

(4) 料液比：固定提取溫度45 ℃、攪拌速率600 r/min、提取時(shí)間1 h，設(shè)置料液比為1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14(g/mL)，考察料液比對竹豆清蛋白提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)選取了攪拌速率、攪拌溫度、攪拌時(shí)間、料液比4個因素作為工藝參數(shù)，以竹豆清蛋白的提取率為參考指標(biāo)。根據(jù)Box-Behnken的原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立相關(guān)模型，確定最優(yōu)提取工藝。

1.3.6 竹豆清蛋白提取率的計(jì)算

(1)

式中：

E——提取率，%；

m——竹豆清蛋白質(zhì)量，g；

M——竹豆干豆的質(zhì)量，g；

w——竹豆干豆中總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%(前期測得為20.5%)。

1.3.7 竹豆清蛋白的亞基組成 精確稱取竹豆清蛋白1 g (精確至0.001 g)至100 mL蒸餾水中，超聲提取15 min，離心(4 000 r/min, 4 ℃, 15 min)取上清，作為待測液。取100 μL 樣液，加20 μL 5×Sample Loading Buffer[組分：250 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8); 0.5% Bromophenol Blue; 10% SDS;50% Glycerol; 7.5% DTT]，100 ℃煮沸5 min，取10 μL上樣。分別制備5%濃縮膠和12%分離膠，對其進(jìn)行不連續(xù)垂直電泳，設(shè)置濃縮膠電壓70 V 分離膠110 V ，至溴酚藍(lán)跑至分離膠底部1 cm處結(jié)束。采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，充分脫色后拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹豆基本成分

竹豆基本成分見表1。

表1 竹豆基本成分含量

2.2 竹豆清蛋白等電點(diǎn)

由圖1可知，竹豆清蛋白在pH 3.5～4.5時(shí)有較低的溶解度，在pH 4.0時(shí)最低，該處即為其等電點(diǎn)。研究[18]表明大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處起泡性最差，但起泡穩(wěn)定性較好；劉永創(chuàng)等[19]發(fā)現(xiàn)等電點(diǎn)處的大豆分離蛋白比中性條件下制備的乳液具有更高的乳化穩(wěn)定性及儲藏穩(wěn)定性。因此，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)對其功能性質(zhì)的研究具有重要意義。

圖1 竹豆清蛋白的等電點(diǎn)測定

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 攪拌速率對竹豆清蛋白的影響 由圖2可知，竹豆清蛋白提取率隨攪拌速率先上升后下降，最后趨于平穩(wěn)，當(dāng)攪拌速率為400 r/min時(shí)，提取率達(dá)到最高。在一定范圍內(nèi)，增加攪拌速度可以促進(jìn)蛋白與水分子的接觸，促進(jìn)溶解，但達(dá)到一定限度后，過高的攪拌速率產(chǎn)生的剪切力可能導(dǎo)致蛋白變性，破壞其原有結(jié)構(gòu)[20]144-153，使溶解度降低，提取率降低。

圖2 攪拌速率對竹豆清蛋白提取率的影響

2.3.2 攪拌溫度對竹豆清蛋白提取率的影響 由圖3可知，在35～45 ℃時(shí)竹豆清蛋白提取率隨溫度升高而逐漸增大，在50 ℃時(shí)下降較為緩慢，而在55 ℃時(shí)急速下降。這是因?yàn)樵?5～45 ℃時(shí)，竹豆清蛋白的水合能力隨著溫度的升高而增強(qiáng)，而隨著溫度的進(jìn)一步升高，氫鍵作用和離子基團(tuán)的水合作用減弱，蛋白質(zhì)水合能力下降[20]130-131，提取率隨之下降。而在55 ℃時(shí)，下降極為顯著，可能是此時(shí)溫度過高，蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致變性聚集。

圖3 攪拌溫度對竹豆清蛋白提取率的影響

Figure 3 Effect of stirring temperature on the extraction rate of bamboo bean albumin

2.3.3 攪拌時(shí)間對竹豆清蛋白提取率的影響 由圖4可知，竹豆清蛋白提取率在攪拌時(shí)間為1.5 h達(dá)到最大。當(dāng)攪拌時(shí)間為0.5～1.5 h時(shí)，竹豆清蛋白充分展開，同水穩(wěn)定結(jié)合，逐步接近飽和，提取率上升；而在1.5 h后，清蛋白與水分子結(jié)合達(dá)到飽和，增加攪拌時(shí)間只會破壞維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作用力的平衡，部分基團(tuán)的水化層被破壞，使原來結(jié)合好的蛋白質(zhì)分子又脫離水分子，提取率下降。

2.3.4 料液比對竹豆清蛋白提取率的影響 由圖5可知，竹豆清蛋白提取率隨提取溶劑體積量增大而先增后降，且增減幅度較大，在料液比為1∶12 (g/mL)時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)溶劑較少時(shí)，竹豆清蛋白隨著溶劑的增加充分浸出，同水結(jié)合越充分，提取率增大，在料液比為1∶12 (g/mL)時(shí)，同水結(jié)合力達(dá)到最大；而溶液較多時(shí)，竹豆清蛋白過度腫脹，與水結(jié)合力減弱，提取率下降。

圖4 攪拌時(shí)間對竹豆清蛋白提取率的影響

Figure 4 Effect of stirring time on the extraction rate of bamboo bean albumin

圖5 料液比對竹豆清蛋白提取率的影響

Figure 5 Effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of bamboo bean albumin

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 響應(yīng)面因素與水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見表2、3。

2.4.2 模型的建立與分析 采用Design-Expert 8.05b軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得回歸方程：

Y=26.55-0.022A-0.26B+1.54C-2.75D+0.56AB-0.58AC+0.96AD-0.32BC+0.19BD+0.21CD-1.36A2-1.32B2-5.19C2-3.73D2。

(2)

其中，校正系數(shù)R2=0.993 4，變異系數(shù)CV=1.88%，說明該模型擬合度較好，可對竹豆清蛋白的提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測，能較好地反映真實(shí)值。

響應(yīng)面數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表4，結(jié)果顯示模型P<0.000 1，表明回歸模型極顯著。失擬誤差P=0.092>0.05，表明所用模型與試驗(yàn)擬合誤差不顯著，未知因素對試驗(yàn)干擾少，數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確[21]。由表4可知，單因素對竹豆清蛋白提取率影響順序依次為：D>C>B>A；因素之間交互作用大小依次為：AD>AC>AB>BC>CD>BD；各因素的二次方對提取率影響大小為： C2>D2>A2>B2。

表2 響應(yīng)面因素與水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.3 響應(yīng)曲面三維圖和等高線分析 竹豆清蛋白提取的等高線圖與響應(yīng)面3D圖見圖6～8。由圖6可知，響應(yīng)曲面較陡峭，等高線形狀為寬橢圓，表明攪拌速率和溫度對竹豆清蛋白提取率具有較顯著影響；由圖7可知，響應(yīng)曲面陡峭，等高線形狀為較細(xì)橢圓，表明攪拌速率和時(shí)間交互作用顯著，且時(shí)間對提取率的影響大于攪拌速率；由圖8可知，響應(yīng)曲面比之前更加陡峭，橢圓形狀更細(xì)長，表明攪拌速率和料液比之間的交互作用更加顯著，這也與方差分析結(jié)果相一致，表明了模型的可靠性與真實(shí)性。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表?

? *差異顯著，P<0.05；** 差異極顯著，P<0.01。

圖6 攪拌速率和溫度對竹豆清蛋白提取率的響應(yīng)面與等高線圖

圖7 攪拌速率和時(shí)間對竹豆清蛋白提取率的響應(yīng)面與等高線圖

圖8 攪拌速率和料液比對竹豆清蛋白提取率的響應(yīng)面與等高線圖

2.5 最佳工藝參數(shù)確定與模型驗(yàn)證

通過響應(yīng)面模型可知，提取竹豆清蛋白的最佳工藝為：攪拌速率355.83 r/min、提取溫度44.02 ℃、提取時(shí)間1.58 h、料液比1∶11.20 (g/mL)，提取率的預(yù)測值為27.25%。為實(shí)際操作方便，將最佳參數(shù)調(diào)整為：攪拌速率356 r/min、提取溫度44 ℃、提取時(shí)間1.5 h、料液比1∶11.20 (g/mL)，此條件下提取率為27.56%(n=3)，與預(yù)測值相差1.14%，說明該模型用于提取竹豆清蛋白是可靠的。最優(yōu)條件下，竹豆清蛋白純度為(86.50±2.17)% (n=3)，與其他豆類蛋白[22]比較，純度相差不大，可用于后續(xù)功能性質(zhì)的研究。

2.6 竹豆清蛋白的亞基組成

竹豆清蛋白的SDS-PAGE電泳如圖9所示，通過Image Lab軟件，將蛋白質(zhì)Marker的分子量對數(shù)(y)與條帶相對遷移率(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-2.4x+2.88，R2=0.983 3。將竹豆清蛋白條帶相對遷移率帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算其主要亞基分子量。竹豆清蛋白含有9個亞基條帶，分別為

圖9 竹豆清蛋白的SDS-PAGE還原電泳

1.3.3，103.5，94.6，49.6，35.3，32.3，27.6，24.0，19.7 kDa。其中最主要亞基分布在49.6，27.6 kDa，分別占總量的61.1%，20.6%，與李永武[8]42-45提取的綠豆清蛋白亞基分子量分布相似。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗(yàn)確定竹豆清蛋白的最佳提取工藝為：攪拌速率356 r/min、提取溫度44 ℃、提取時(shí)間1.5 h、料液比1∶11.20 (g/mL)，在此條件下提取率為27.56%，純度為(86.50±2.17)%。SDS-PAGE電泳分析表明，竹豆清蛋白含有9個亞基條帶，其中最主要亞基分布在49.6，27.6 kDa。

目前，關(guān)于竹豆清蛋白提取工藝報(bào)道幾乎沒有，通過優(yōu)化其提取工藝，有助于獲得更高產(chǎn)量的竹豆清蛋白；通過SDS-PAGE電泳進(jìn)一步分析亞基組成，為進(jìn)一步研究其功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征提供理論依據(jù)，有助于竹豆清蛋白在食品領(lǐng)域的加工及應(yīng)用。