郭全友王曉晉,2姜朝軍

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

南美白對蝦(Penaeusvannamei)原產(chǎn)于中、南美洲太平洋沿岸的溫暖水域，年產(chǎn)8.93×105t，與斑節(jié)對蝦和中國對蝦合稱世界三大養(yǎng)殖蝦類[1]。新鮮南美白對蝦富含蛋白質(zhì)，具有良好的氨基酸比例[2]，主要以鮮活、冷凍和熟制品等流通為主，但鮮活蝦的運輸條件嚴(yán)苛，成本昂貴[3]，冷凍蝦貯藏耗能大，且會造成持水率下降，影響口感[4]。熟制即食南美白對蝦蝦仁經(jīng)脫殼、去腸線、調(diào)味、低溫干燥、溫和殺菌和真空包裝等制作而成，具有質(zhì)地柔軟、口感好和無需冷凍等特點，具有良好的市場前景。但由于南美白對蝦富含蛋白質(zhì)，在加工、貯藏和運輸中易受微生物和酶等物理化學(xué)因素的影響，易于腐敗變質(zhì)[5]。因此，采用高效殺菌方法和抑菌手段，對控制微生物及延長貨架期十分必要。

為保證熟制品食品品質(zhì)和安全，常采用新型殺菌(如微波和紅外線等)或柵欄技術(shù)來殺滅和抑制目標(biāo)微生物的生長，實現(xiàn)延長產(chǎn)品貨架期和品質(zhì)損失最小化的統(tǒng)一。例如采用微波(750 W，80 s)處理后的帶魚段與未經(jīng)過微波處理相比，常溫貯藏貨架期可延長4倍[6]； Huang等[7]采用紅外線對熱狗表面進(jìn)行殺菌，80 ℃、3 min或85 ℃、2 min處理后菌落總數(shù)分別下降了6.4，6.7 lg CFU/g，且處理前后感官品質(zhì)無顯著差異。針對不同產(chǎn)品的目標(biāo)微生物，采用高效抑菌因子和強(qiáng)度，可有效保障產(chǎn)品品質(zhì)和安全性，如劉曉莉等[8]采用涂抹柑橘提取物可有效延緩冰藏南美白對蝦質(zhì)量惡化，魯淑彥等[9]通過控制水分含量和水分活度等因子優(yōu)化了軟烤對蝦質(zhì)構(gòu)。

水產(chǎn)品鮮度品質(zhì)和貨架期評價常采用感官、微生物、理化及電子鼻等進(jìn)行綜合分析，如Le等[10]采用感官評價、TVBN和三甲胺等腐敗指標(biāo)，確定0 ℃貯藏中國對蝦的貨架期為8 d； Mohana等[11]采用菌落總數(shù)和過氧化物分析，得出采用可食用膜包裝的牛肉10，4 ℃貨架期分別為22，32 d；郭淼等[12]采用TVBN、質(zhì)構(gòu)和電子鼻能有效預(yù)測新鮮金鯧魚貨架期。熟制水產(chǎn)品在加工和貯藏過程中，由于殺菌不均和貯藏不當(dāng)，可能會發(fā)生脹袋變質(zhì)，婁永江等[13]采用PCR測序法確認(rèn)真空包裝即食海蜇的優(yōu)勢腐敗菌為芽孢桿菌、假單胞菌和腐敗希瓦氏菌等。因此，需采用感官、色澤、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、化學(xué)和微生物等多項指標(biāo)對即食南美白對蝦貨架期和殘留菌確認(rèn)進(jìn)行研究。

本試驗擬采用感官、理化、微生物和電子鼻等確定南美白對蝦即食蝦仁(簡稱即食蝦仁)貯藏期品質(zhì)變化和貨架期，并采用16S rRNA序列鑒定殘留菌種類，為進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)品改進(jìn)配方等提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮南美白對蝦：寧德閩東水產(chǎn)品批發(fā)市場，低溫致死，冰鮮蝦運達(dá)寧德市某水產(chǎn)公司進(jìn)行試制；

HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.01 mol/L，深圳市博材達(dá)科技有限公司；

營養(yǎng)瓊脂：AR級，上海市國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

水分活度儀：LAB-Touch型，瑞士NOVASINA公司；

水分含量測定儀：PMB35型，英國艾德姆衡器公司；

pH測定儀：pHS-3C型，儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

自動定氮儀：KDN-103F型，上海纖檢儀器有限公司；

潔凈工作臺：SW-CJ-1FB型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

高精密度低溫培養(yǎng)箱：MIR-153型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

電子鼻：PEN 3型，德國Airsense公司；

色差儀：CR-400型，日本CHROMA METER 公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TMS-Pro型，美國Food Technology 公司；

真空快速冷卻機(jī)：FD-50L型，上海福帝包裝機(jī)械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

冰鮮蝦→預(yù)煮(一次殺菌)→脫殼去腸線→調(diào)味(乳酸、鹽和糖等)→干燥(微波干燥85 ℃、15 min)→拉伸膜真空包裝(PA/EVOH/PE膜，絕對壓力≤200 Pa)→二段殺菌(微波95 ℃、25 min；紅外線80 ℃、5 min)→真空快速冷卻，成品放入高精度培養(yǎng)箱(25±1) ℃貯藏

1.2.2 感官評價 依據(jù)SC/T 3305—2003《烤蝦》標(biāo)準(zhǔn)的感官要求，合格品分為3個等級，并參考文獻(xiàn)[14]制定感官評價標(biāo)準(zhǔn)(表1)。由10名專業(yè)人員組成感官評價小組，對樣品形態(tài)、色澤、風(fēng)味及滋味和組織進(jìn)行評價，單項指標(biāo)均采用10分制，單個指標(biāo)權(quán)重相等，綜合評分10分為品質(zhì)最好，4分為可接受點，<4分為感官拒絕，1分為最差，單項評分和綜合評分用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.2.3 菌落總數(shù)(Total viable count，TVC)測定 按GB 4789.2—2016執(zhí)行。

1.2.4 理化指標(biāo)

(1) 水分含量：采用水分分析儀測定。

(2) 水分活度：采用水分活度儀測定。

(3) pH值：采用酸度計測定。

(4) 鹽分：按GB/T 12457—2008執(zhí)行。

(5) 揮發(fā)性鹽基氮(Ttotal volatile basic nitrogen，TVBN)測定：按SC/T 3032—2007執(zhí)行；

(6) 硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)的測定：參照文獻(xiàn)[15]。

(7) 色差值測定：采用CR-400型色差儀，以標(biāo)準(zhǔn)白板為基準(zhǔn)，對樣品進(jìn)行測定。按式(1)計算色差值。

表1 即食蝦仁感官評價標(biāo)準(zhǔn)

(1)

式中：

L*——黑白(亮)度；

a*——紅綠度(a+，紅度；a-，綠度)；

b*——黃藍(lán)度(b+，黃度；b-，藍(lán)度)。

(8) 電子鼻分析：取待測樣品10 g剪碎，分裝于頂空近樣瓶，置于25 ℃，氣味富集10 min后電子鼻檢測，取進(jìn)樣的第59 s氣味數(shù)據(jù)作為有效數(shù)據(jù)，采用主成分分析法，線性判別法和傳感器區(qū)別貢獻(xiàn)率分析法作為主要區(qū)別分析方法。電子鼻各傳感器性能描述見表2。

表2 傳感器性能描述

(9) 質(zhì)構(gòu)測定：采用TMS-Pro型物性分析儀測定，以TPA 1000N P/5柱形探頭，剪切力1 000 N模式進(jìn)行測試，參數(shù)設(shè)置參考文獻(xiàn)[9]并稍加修改：測試探頭擠壓速度50 mm/min，形變量50%，觸發(fā)類型自動0.2 N，回縮距離20 mm。TPA 1 000 N感應(yīng)源探頭對蝦仁第二腹節(jié)測定樣品硬度和彈性等指標(biāo)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”形式表示。

1.2.5 貨架期評定 參照SC/T 3305—2003和感官評價(<4 分為感官拒絕點)，結(jié)合TVBN ≤ 40 mg/100 g、菌落總數(shù)≤3×104CFU/g等指標(biāo)綜合判定貨架期。

1.2.6 殘留菌的分離與鑒定

(1) 殘留菌的分離與純化：取貨架期終點個別發(fā)生脹袋的即食對蝦，無菌室開袋稱量10 g加入90 mL生理鹽水，加塞密封，震蕩5 min，10倍稀釋至合適梯度，涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上。(30±1) ℃恒溫培養(yǎng)(72±3) h，選取菌落分布均勻的平板，依據(jù)菌落形態(tài)特征分組，純化培養(yǎng)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》并采用16S rRNA序列對菌株進(jìn)行鑒定。

(2) 16S rRNA序列測定：挑取菌落于營養(yǎng)肉湯中25 ℃ 過夜培養(yǎng)。取該菌液1.5 mL于EP管中，5 000 r/min離心5 min，按照TIANGEN細(xì)菌DNA提取試劑盒步驟提取菌株DNA，并進(jìn)行PCR序列擴(kuò)增，將擴(kuò)增序列送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Oringin 8.0對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用SPSS 18.0(PASW Statistics，inc)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 常溫貯藏品質(zhì)變化

2.1.1 感官評價 感官評價是食品評價最直觀的手段，可通過蝦的形態(tài)、色澤、氣味及滋味和組織綜合評價產(chǎn)品品質(zhì)，確認(rèn)貨架期[15]。由圖1可見，即食蝦仁形態(tài)、色澤、氣味及滋味和組織隨貯藏時間的延長，色澤由固有紅色變成偏黃色，光澤度下降，但是蝦色澤均勻；氣味由濃郁蝦香味變淺變淡，滋味和鮮嫩度下降，組織由嚼勁變?yōu)榛居薪绖?。?個月時，氣味及滋味和組織評分分別為(4.3±0.30)，(4.5±0.2)分，接近拒絕點。綜合評分隨著貯藏時間的延長而降低，第9個月時，綜合評分為(5.8±0.2)分，考慮氣味及滋味和組織接近感官拒絕點，綜合各項指標(biāo)判定產(chǎn)品為貨架期終點。綜合顯示，即食蝦仁貯藏期氣味及滋味劣變較質(zhì)地和色澤出現(xiàn)的早，與王煥慶等[14]對高水分蝦常溫貯藏時外觀劣變明顯早于色澤、風(fēng)味和質(zhì)地不同，可能與殺菌手段和包裝材料等差異有關(guān)。

圖1 即食蝦仁貯藏期間感官評價

Figure 1 The Sensory evaluation of ready-to-eat shelled shrimp stored at ambient temperature

2.1.2 色差評價 顏色評價是感官評價食品質(zhì)量的一個因素，且它是消費者評價食品的首要質(zhì)量參數(shù)，在產(chǎn)品驗收中是至關(guān)重要的[16]。由圖2可知，即食對蝦的L*、a*、b*和△E*值在貯藏4個月前不存在顯著性差異(P>0.05)，4個月后a*、b*、L*和△E*存在較大波動，但貯藏前后差異性不顯著。與感官評價相比，色差值在貯藏4個月時發(fā)生波動，在貯藏的第9個月亮度呈增高趨勢，紅度呈降低趨勢，可能是蝦青素或者其它色素結(jié)合蛋白降解導(dǎo)致的。Niamnuy等[17]研究表明蝦顏色的變化與蝦青素的氧化分解和異構(gòu)化存在良好相關(guān)性，蝦青素的氧化導(dǎo)致蝦的紅度和黃度的降低。可見如果延長貯藏時間，將會失去其原有色澤，影響銷售。但感官評價中色澤直到貯藏6個月才發(fā)生顯著性變化。說明色差儀的靈敏性高于肉眼，可及時反映即食對蝦品質(zhì)變化。

圖2 即食蝦仁常溫貯藏色差變化

Figure 2 The color changes of ready-to-eat shelled shrimp stored at ambient temperature

2.1.3 氣味分析 電子鼻對揮發(fā)性氣味物質(zhì)有較高靈敏度，可通過指紋識別和特定算法區(qū)分不同貯藏期食物新鮮度[18-19]。圖3為電子鼻對不同貯藏期的即食對蝦蝦仁氣味的主成分分析，可見貯藏1，5，9個月的主成分分布在坐標(biāo)軸的不同位置，不存在重疊，由此可見電子鼻可區(qū)分不同貯藏期對蝦。圖4為電子鼻傳感器貢獻(xiàn)率分析圖，傳感器陳列進(jìn)行主成分分析得到的主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率分別為99.896%，0.103%，二者貢獻(xiàn)率之和接近100%，說明兩主成分具有代表性。圖4可見氣味差異重點表現(xiàn)在W1W(硫化物)，與新鮮南美白對蝦腐敗過程中硫化物貢獻(xiàn)值一致，可能與蛋氨酸分解有關(guān)[20]。

2.1.4 質(zhì)構(gòu)分析 質(zhì)構(gòu)特性是評價食品品質(zhì)的重要因素，可客觀反映食品質(zhì)地并區(qū)分食物等級[21]。由圖5可知，即食蝦仁咀嚼性、硬度在貯藏3個月內(nèi)無顯著差異(P>0.05)，3個月后，咀嚼性和硬度分別由起初的(146.81±5.02) kJ、(117.32±6.56) N增長為(219.62±7.07) kJ、(147.725±3.270) N，6個月后呈明顯下降趨勢。同時彈性也呈先升高后下降的趨勢，但內(nèi)聚性存在較大波動。這是因為隨著貯藏時間的延長，水分散失組織變緊密等。6個月后咀嚼性、硬度和彈性下降是因為蛋白氧化分解，組織變軟等，而內(nèi)聚性受影響因素較多，存在波動性[22]。

圖3 即食蝦仁常溫貯藏電子鼻主成分分析

Figure 3 Principle component analysis of ready-to-eat shrimp stored at ambient temperature

圖4 即食蝦仁常溫貯藏傳感器貢獻(xiàn)率分析

Figure 4 Sensor contribution rate of ready-to-eat shrimp stored at ambient temperature

圖5 即食蝦仁常溫貯藏質(zhì)構(gòu)特性變化

2.1.5 TVBN和TBA變化 TVBN和TBA是食物腐敗的重要指標(biāo)，TVBN主要指氨、胺類物質(zhì)，TBA主要是脂肪二級氧化物，TVBN和TBA越高，食物腐敗程度越高[23-24]。圖6為貯藏期即食蝦仁TBA和TVBN的變化。由圖6可見，TBA和TVBN在前4個月內(nèi)無顯著差異，4個月后分別由起初的(0.028±0.002)，(10.48±0.03) mg/100 g增長到(0.199±0.001)，(17.08±0.10) mg/100 g，可能是包裝材料具有一定通透性，使得脂肪和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化分解；TVBN低于20 mg/100 g，達(dá)到二級制品水平；即食對蝦在貯藏9個月后TBA值仍處于高品質(zhì)階段(TBA值<0.3 mg/100 g[25])，可能與包裝材料PA/EVOH/PE膜的封閉性和水分活度低于0.93不適于芽孢桿菌生長等有關(guān)[26]。

圖6 即食蝦仁常溫貯藏TBA和TVBN的變化

Figure 6 The changes in TBA, TVBN and pH of ready-to-eat shelled shrimp stored at ambient temperature

2.2 微生物特征及抑菌柵欄

2.2.1 菌落總數(shù)與殘留菌鑒定 表3為即食蝦仁菌落總數(shù)變化，可見各貯藏階段TVC存在一定波動，但均<3×104CFU/g，符合SC/T 3305—2003限量要求，表明該產(chǎn)品處在安全范圍內(nèi)。研究[27]表明：TVC能有效指示食品的質(zhì)量，TVC<106CFU/g時，不存在高風(fēng)險，香港、澳大利亞、新西蘭和英國的TVC限量范圍為103～107CFU/g，但不能直接進(jìn)行安全評估，貨架期內(nèi)TVC升高，表明存在潛在安全問題。

從脹袋即食蝦仁中僅分離出2種菌S1(65%)和S2(35%)，見圖7。16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，S1、S2與地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的同源性分別為100%和99%。芽孢桿菌常存在于即食制品中[28]，可能是芽孢桿菌抗逆性強(qiáng)，難以將其徹底殺滅。

表3 即食蝦仁常溫貯藏菌落總數(shù)變化

圖7 即食蝦仁中殘留菌16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 7 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences of the residue bacteria in ready-to-eat shelled shrimps

2.2.2 抑菌柵欄效應(yīng) 合理的選擇柵欄因子和強(qiáng)度可有效抑制腐敗菌生長，多種柵欄因子協(xié)同抑菌效果較好。pH、鹽分和水分活度是控制貨架期的重要柵欄因子，水分活度越高，貨架期越短，水分活度<0.95時，多數(shù)細(xì)菌不能生長，水分活度<0.83時，多數(shù)霉菌不能生長[29]。圖8為貯藏期即食蝦仁的柵欄因子pH、鹽分、水分活度和水分含量的變化狀況。圖8可見，pH、鹽分、水分活度和水分含量在前4個月無顯著差異，4個月后均呈顯著性變化，pH和鹽分顯著性增加，分別由(6.36±0.10)%，(2.41±0.03)%增長到(6.64±0.11)%，(2.77±0.10)%；水分含量和水分活度顯著性降低，分別由(49.12±0.30)%，(0.918±0.01)%下降到(47.62±0.21)%，(0.90±0.01)%。水分活度<0.93時，可有效抑制芽孢桿菌的增值，即食蝦仁初始水分活度為0.918低于0.93，可有效控制芽孢桿菌的生長，且在低水分活度時，芽孢桿菌更易滅活[30-31]。

不同字母表示在P<0.05水平上存在顯著差異

2.3 貨架期確認(rèn)

綜合感官、化學(xué)和微生物等評定指標(biāo)，即食蝦仁在貯藏期間TVBN、TBA和菌落總數(shù)值未超過限定值，感官評價中氣味、滋味和組織的分值到第9個月時接近感官拒絕點，確定其貨架期為9個月。

3 結(jié)論

南美白對蝦即食蝦仁在二次殺菌和真空、Aw及pH抑菌因子等作用下，蛋白質(zhì)、脂肪、灰分和能量符合食用標(biāo)準(zhǔn)，具有高蛋白、低脂肪的特點；重金屬、微生物、生物胺的含量均未超過相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。在常溫貯藏過程中產(chǎn)品TBA、TVBN和TVC等存在變化，但均未超過限定值，綜合感官、理化和微生物指標(biāo)確定即食蝦仁貨架期為9個月。個別發(fā)生脹袋的即食蝦仁優(yōu)勢腐敗菌為芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)，耐高溫，抗逆性強(qiáng)，是其得以殘存的主要原因。常溫貯藏期間，即食蝦仁質(zhì)構(gòu)和色澤發(fā)生變化時間一致，且氣味變化早于質(zhì)構(gòu)和色澤。通過電子鼻測試得出硫化物為主要變化氣體成分，通過質(zhì)構(gòu)儀可得出不同貯藏期色差、彈性、硬度等指標(biāo)的變化，但感官評價難以判斷出氣體成分、色差和質(zhì)構(gòu)的細(xì)微變化。可見，結(jié)合感官、質(zhì)構(gòu)儀、色差儀和其他手段評價即食蝦仁貨架期和品質(zhì)十分必要，為深入開展低溫殺菌、靶向抑菌和優(yōu)化配方等提供支撐。