文海若邵安良陳 亮 淡 墨 胡燕平王 雪 * 徐麗明*

( 1．中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，藥物非臨床安全性評價研究北京市重點實驗室，北京 100176；2．中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所，北京 102629 )

國際標(biāo)準(zhǔn)《納米技術(shù)-術(shù)語和定義-第二部分：納米對象》(Nanotechnologies-Vocabulary-Part 2： Nano-objects， ISO/TS 80004-2：2015)對納米粒子(nanoparticle)的定義[1]為：微小的物體(長度范圍約1～100 nm)，所有外部尺寸在納米級，其中納米物體最長和最短軸的長度無顯著差異。如果尺寸差異顯著(通常超過3倍)，則為納米纖維或納米板。納米材料獨特的物理化學(xué)性質(zhì)及其與生物體相互作用的特性為其在食品加工、抗菌產(chǎn)品生產(chǎn)、藥物載體開發(fā)、腫瘤診療、體內(nèi)示蹤等領(lǐng)域提供了廣泛的應(yīng)用前景[2]，與此同時，也可能帶來潛在的安全風(fēng)險。大量納米材料的涌現(xiàn)，極大程度上增加了人體與納米材料接觸的機(jī)會，因此納米材料的安全性評價成為關(guān)注的熱點。如何合理評價納米材料對人體的潛在毒性，特別是慢性或者長期毒性，預(yù)測其潛在毒性風(fēng)險是目前學(xué)術(shù)界及各相關(guān)監(jiān)管部門亟需解決的問題。

遺傳毒性研究是非臨床安全性評價的重要內(nèi)容，是食品添加劑、化妝品、醫(yī)療器械、藥物等產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗及上市前必須開展的研究項目。對納米材料的潛在遺傳毒性、致癌和致畸作用評估，是評價納米材料對人體安全性風(fēng)險中極為重要的一環(huán)[3]。納米材料的遺傳毒性研究，已發(fā)展成一個專門的亞分支研究領(lǐng)域——納米遺傳毒理學(xué)[4]。大量文獻(xiàn)研究顯示某些納米材料存在遺傳毒性，且遺傳毒性可能與納米尺度有關(guān)。如非納米尺度的二氧化鈦(TiO2)的遺傳毒性為陰性，而成為納米尺度的TiO納米材料時遺傳毒性試驗結(jié)果可為陽性[5]。納米粒子的尺

2寸效應(yīng)和表面活性高等特點使它極易透過細(xì)胞膜，可在表面活性和蓄積性的共同作用下，對細(xì)胞遺傳物質(zhì)產(chǎn)生直接或間接的相互作用。尤其是攜帶金屬離子的納米粒子進(jìn)入體內(nèi)后有可能通過氧化應(yīng)激等作用機(jī)制誘發(fā)染色體或DNA斷裂[6]。然而，當(dāng)前經(jīng)典的遺傳毒性試驗方法對納米材料的評價存在一定局限性。

本文就當(dāng)前安全性評價常用的遺傳毒性試驗方法評價納米材料遺傳毒性的優(yōu)勢和局限性進(jìn)行綜述，根據(jù)遺傳毒性試驗選擇的基本原則，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(The Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)納米材料產(chǎn)品工作 組 (Working Party on Manufactured Nanomaterials， WPMN)于2014年發(fā)布的《納米材料產(chǎn)品遺傳毒性：OECD專家專題研討會報告 納米材料產(chǎn)品安全性系列文件N0.43》[7]和OECD遺傳毒性指導(dǎo)原則[8]，就適宜納米材料的遺傳毒性評價方法組合提出可選擇的遺傳毒性試驗方法，以及推薦使用的試驗組合方案，供納米材料毒性評價和審評工作者參考。

1 納米材料遺傳毒性的特殊性

遺傳毒性試驗的目的是通過一系列試驗預(yù)測受試物是否有遺傳毒性，從而對受試物的潛在致癌性進(jìn)行預(yù)測。就納米材料開展遺傳毒性評價，有助于降低人群接觸納米材料的毒性風(fēng)險。遺傳毒性試驗方法眾多，根據(jù)試驗系統(tǒng)不同可分為體外和體內(nèi)試驗；根據(jù)檢測方法針對與腫瘤相關(guān)的遺傳終點，可大致分為3類，即基因突變、染色體損傷和DNA斷裂。目前沒有任何單一的試驗方法可同時涵蓋所有遺傳終點。為全面考察受試物的潛在遺傳毒性風(fēng)險，通常需開展一系列機(jī)制上互相補充的試驗，即標(biāo)準(zhǔn)化試驗組合，來進(jìn)行綜合性評價[8]。人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)在遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)試驗組合S2(R1)中要求，標(biāo)準(zhǔn)試驗組合的選擇應(yīng)針對不同的遺傳終點，包括體外和體內(nèi)研究[8]。

納米材料緩慢進(jìn)入細(xì)胞又緩慢從細(xì)胞中釋放，以及體內(nèi)臟器分布(易于分布于肝、腎、肺、腦及免疫器官等)、蓄積性和緩釋效應(yīng)這些特點，與普通化合物和小分子生物制品有所區(qū)別，現(xiàn)行經(jīng)典的遺傳毒性評價方法可能無法有效而可靠地進(jìn)行評價。比如，與嚙齒類動物腫瘤相關(guān)度最高的傳統(tǒng)細(xì)菌回復(fù)性突變試驗無法有效檢出納米粒子的潛在致突變性，而體外微核試驗、染色體畸變試驗及彗星試驗卻通?？梢缘玫疥栃越Y(jié)果[9]。此外，納米材料進(jìn)入體內(nèi)后，長期存在并蓄積于某些臟器無法排出，是否會對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響進(jìn)而誘發(fā)腫瘤也是需要考慮的重要因素之一。研究顯示大鼠靜脈注射納米粒子后血液中納米粒子短時間內(nèi)快速清除，大量納米粒子由循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入組織[10]。而主要針對化學(xué)藥物設(shè)計的體內(nèi)遺傳毒性研究通常使用外周血作為監(jiān)測窗，采樣時間較短，容易對納米粒子的遺傳毒性進(jìn)行誤判。在開展體內(nèi)毒性研究時，需要結(jié)合其體內(nèi)代謝和分布研究結(jié)果來進(jìn)行毒性評價，并重點關(guān)注其靶器官遺傳毒性。

法國藥監(jiān)局(Agence Nationale de Sécurité d u Mé dicament et des Produits de Santé，ANSM)在2011年發(fā)布的《含納米材料醫(yī)療器械的生物學(xué)評估》的科學(xué)報告中指出由于大量納米材料遺傳毒性研究缺乏關(guān)于納米材料理化性質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)以及標(biāo)準(zhǔn)化而統(tǒng)一的試驗方法和試驗條件，不同研究中納米材料的遺傳毒性研究結(jié)果并不一致，難以對很多納米材料的遺傳毒性進(jìn)行判斷[11]。歐洲的NANOGENOTOX納米遺傳毒理計劃就15種代表性納米材料(包括5種納米二氧化鈦，4種合成無定形二氧化硅，6種多壁碳納米管)使用一致的評價方法和評價標(biāo)準(zhǔn)開展試驗研究并獲得一定研究數(shù)據(jù)可用于分析參考[11]。OECD WPMN 在《納米材料產(chǎn)品遺傳毒性：OECD專家專題研討會報告 納米材料產(chǎn)品安全性系列文件N0.43》就納米材料遺傳毒性評價中的共性問題達(dá)成7項共識[7]。與會專家建議繼續(xù)對納米材料遺傳毒性相關(guān)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘，以確定是否需要在可能的范圍內(nèi)對遺傳毒性試驗指導(dǎo)原則進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

2 遺傳毒性評價方法存在的問題及建議

2.1 細(xì)菌回復(fù)性突變試驗

2.2 哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗

基于哺乳動物細(xì)胞的小鼠淋巴瘤細(xì)胞tk基因突變試驗(mouse lymphoma assay，MLA)和HPRT基因突變試驗除檢測致突變外，也可用于檢測致斷裂劑。從試驗方法的角度上分析，避免了Ames試驗中試驗對象與受試物無法充分接觸的多種因素，可作為檢測致突變劑的體外備選方法。然而，該方法當(dāng)前主要用于安全性評價，較少應(yīng)用于科研領(lǐng)域，因此使用其開展納米材料評價的文獻(xiàn)很少?；仡櫮壳拔墨I(xiàn)報道[9]，其試驗結(jié)果基本與體外微核試驗相符。Kirkland等[15]根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分析了MLA的預(yù)測效果，認(rèn)為Ames試驗和體外微核試驗已足夠用于預(yù)測嚙齒類動物致癌性和體內(nèi)遺傳毒性；在兩者的基礎(chǔ)上增加MLA后，檢出率僅從78%(316/405)提高至79.5%(322/405)。此外，也有文獻(xiàn)報道使用嚙齒類動物細(xì)胞系開展的與人源細(xì)胞開展的HPRT基因突變試驗檢測納米二氧化鈦和碳納米管的試驗結(jié)果存在一定矛盾，提示不同細(xì)胞系的敏感性及對DNA損傷的修復(fù)能力有所差異，從而對結(jié)果產(chǎn)生影響[16-17]。因此使用哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗檢測納米材料遺傳毒性的可靠性和靈敏性尚有待確認(rèn)，然而由于Ames試驗的不適用性，缺乏適宜的平行對照試驗方法來進(jìn)行相應(yīng)驗證工作。

2.3 體外微核試驗

微核試驗是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。體外微核試驗是常見的評價納米材料遺傳毒性的試驗方法，然而當(dāng)前文獻(xiàn)報道的體外微核試驗方法缺乏一致性[9]，在納米材料暴露時間、添加細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B，cytoB)的方法、全血清或低血清培養(yǎng)條件，以及細(xì)胞系的選擇上存在很大差異。這些試驗條件均可能對研究結(jié)果產(chǎn)生重要影響，導(dǎo)致無法對結(jié)果的可靠性進(jìn)行判斷。

如納米材料進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用的時間較久，建議增加細(xì)胞與納米材料接觸的時間。體外哺乳動物細(xì)胞試驗受試物處理時間至少為24 h，以保證納米材料與遺傳物質(zhì)(直接或間接)充分地接觸。研究顯示細(xì)胞與納米材料作用24 h的檢出率優(yōu)于48 h及更長時間，以及不超過6 h作用時間[9]。納米材料作為異物進(jìn)入細(xì)胞，大多可對細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。胞質(zhì)分裂阻斷法微核試驗添加cytoB形成雙核細(xì)胞模型，通過計數(shù)單核、雙核、三核及更多核細(xì)胞形成率，可驗證其納米顆粒對細(xì)胞增殖的影響。針對雙核細(xì)胞計數(shù)微核的優(yōu)勢是可以排除自發(fā)微核率(單核細(xì)胞微核)對背景值的影響。而胞質(zhì)分裂阻斷法微核試驗中添加的雙核細(xì)胞造模試劑cytoB可干擾細(xì)胞骨架的形成，從而影響細(xì)胞對納米材料的內(nèi)吞作用。cytoB的給藥方法可采用后處理或延遲的共同處理方法，從而保證納米材料可與細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)在無cytoB的情況下充分暴露。當(dāng)前大多數(shù)研究中使用全血清，考慮到全血清條件可能更接近體內(nèi)環(huán)境，然而血清含量可能對細(xì)胞的內(nèi)吞作用產(chǎn)生影響，進(jìn)而導(dǎo)致納米材料進(jìn)入細(xì)胞后對遺傳物質(zhì)的影響有所差異。有研究顯示培養(yǎng)基中的血清含量可對細(xì)胞內(nèi)吞作用產(chǎn)生影響，具體作用可因細(xì)胞類型和納米粒子不同而異。如血清可降低人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)對二氧化硅包被的納米粒子的攝取能力，并抑制MCL-5(人類淋巴母細(xì)胞B細(xì)胞) 對超細(xì)超順磁性氧化鐵納米粒子的攝?。粎s可提高RAW 264.7 (巨噬細(xì)胞)對陰離子磁性納米顆粒的攝取能力[18]。當(dāng)前就體外研究中低血清條件或全血清條件哪一個更為適宜尚無定論。此外，研究顯示細(xì)胞系的選擇可能對評價結(jié)果產(chǎn)生重要影響，腫瘤細(xì)胞系較正常細(xì)胞系更易于獲得陽性結(jié)果。這可能與腫瘤細(xì)胞分化增殖能力旺盛，抗氧化應(yīng)激能力相應(yīng)較差，以及對納米材料的攝取能力較強等因素有關(guān)[19]。建議評價時結(jié)合受試物實際用途和檢測目的，并結(jié)合受試物的主要暴露靶器官，選擇適宜的細(xì)胞系開展試驗[9]。常用的細(xì)胞系包括A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)和HepaRG細(xì)胞(正常人終末分化肝細(xì)胞)等。

2.4 體外染色體畸變試驗

染色體畸變試驗是除微核試驗以外，另一項以染色體損傷為檢測終點的常用遺傳毒性評價方法。該方法通過分析中期分裂相細(xì)胞中染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變化，并計數(shù)異常染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目出現(xiàn)的頻率來評價受試物對染色體的影響。開展體外染色體畸變時在細(xì)胞系的選擇、血清的使用和納米材料與細(xì)胞作用時間上的考量與2.3體外微核試驗相同。含金屬離子的納米材料染色體畸變試驗多顯示為致斷裂性。值得注意的是，某些細(xì)胞周期抑制作用明顯的納米材料(如納米銀)可誘導(dǎo)多倍體發(fā)生率顯著升高[20]。該現(xiàn)象不排除與其抑制細(xì)胞分裂有關(guān)，可開展相關(guān)研究，如染色著絲粒的FISH法體外哺乳動物細(xì)胞微核試驗[21]，區(qū)分納米材料是否有誘發(fā)非整倍體形成的可能，并明確其產(chǎn)生的原因。

2.5 體內(nèi)及體外Pig-a基因突變試驗

位于人的X染色體上的Pig-a基因及其同源基因的編碼區(qū)在人、小鼠、大鼠乃至酵母中高度保守，Pig-a基因突變可導(dǎo)致糖化磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl inositol，GPI)合成障礙，致使細(xì)胞GPI錨蛋白缺失，該缺失可使用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)針對細(xì)胞表面GPI錨連蛋白(如CD59、CD55蛋白)的表達(dá)水平檢出。Pig-a基因突變率可用以評價受試物對基因突變的作用。體內(nèi)試驗以紅細(xì)胞(red blood corpuscle，RBCs)或網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocytes，RETs)表面缺失CD59或者CD55蛋白的發(fā)生率作為Pig-a基因體內(nèi)突變的檢測終點[22]；體外試驗備選細(xì)胞系包括TK6細(xì)胞和L5178Y細(xì)胞，以表型為GPI(-)的細(xì)胞出現(xiàn)率為Pig-a體外突變的檢測終點[23]。Pig-a基因突變試驗作為新興的致突變劑檢測方法當(dāng)前尚處于開發(fā)階段，未經(jīng)過大規(guī)模實驗室間驗證，未形成相關(guān)指導(dǎo)原則，在納米材料毒性評價方面的應(yīng)用更為少見。然而納米材料致突變性的檢測方法有限，該方法或可成為有效的納米材料致突變性檢測方法。

2.6 其他試驗方法

體內(nèi)試驗方法選擇時，需根據(jù)受試物作用機(jī)制和體內(nèi)分布蓄積情況進(jìn)行選擇。其中體內(nèi)紅細(xì)胞微核試驗、體內(nèi)染色體畸變試驗和體內(nèi)彗星試驗的具體方法均有相應(yīng)指導(dǎo)原則參考。彗星試驗可較為靈敏地檢測致斷裂劑的作用[3]，通常體內(nèi)試驗采樣的時間在末次給藥后3 h左右，其中部分?jǐn)嗔芽勺孕行迯?fù)，因此不作為常規(guī)的遺傳毒性評價方法。然而彗星試驗有可針對多種臟器/組織開展研究的優(yōu)勢，可結(jié)合組織分布研究評價受試物的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。在有證據(jù)顯示受試物可致斷裂的情況下，可通過彗星試驗進(jìn)一步分析其對不同臟器的影響。氧化應(yīng)激是納米材料誘導(dǎo)DNA損傷的重要作用機(jī)制。建議開展彗星試驗時增加細(xì)菌甲酰嘧啶DNA糖基化酶(FGP)、核酸內(nèi)切酶III、8羥基鳥苷DNA糖基化酶(hOGG1)等預(yù)處理，有助于分析斷裂作用是否與氧化應(yīng)激有關(guān)[24]。正式試驗之前，需對FGP的處理條件進(jìn)行充分驗證，避免獲得假陽性結(jié)果。針對DNA雙鏈斷裂的γ-H2AX作為遺傳毒性生物標(biāo)志物或有一定的應(yīng)用價值。

在體內(nèi)致突變性方面，考慮到納米材料體內(nèi)蓄積引起的毒性，嚙齒類轉(zhuǎn)基因動物模型，如MutaMouse，BigBlue?，Gptdelta轉(zhuǎn)基因小鼠均可結(jié)合重復(fù)給藥試驗檢測納米材料的潛在長期致突變效應(yīng)[25]。

而使用放射性試劑3H-TdR標(biāo)記的體內(nèi)哺乳動物肝細(xì)胞非程序性DNA合成試驗，在使用條件上存在一定局限性。

家住在石門鄉(xiāng)間，前后有兩個小小的院子，于是，也種了不少雜七雜八的植物，按著季節(jié)，也會開出不少好看的花。有時候在廊前一坐，桂花送來淡淡的清香，覺得自己好像也安靜古雅了起來。夏天的傍晚，茉莉會不停地開，摘下兩三朵放在手心里，所有青春的記憶都會隨著它的香氣出現(xiàn)在我眼前。我想，我愛的也許并不是花，而是所有逝去的時光，在每一朵花后面，都有著我珍惜的記憶。

綜上所述，按遺傳毒性評價終點對評價方法進(jìn)行分類，就這些方法存在的問題和可能的改良建議進(jìn)行總結(jié)，見表1。

3 遺傳毒性試驗方法的特殊關(guān)注點

3.1 納米材料的制備

納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)是其毒性強弱和毒性特點的重要影響因素。相同組分的材料成為納米材料時，其生物體內(nèi)代謝動力學(xué)、長期體內(nèi)分布及蓄積的特征可發(fā)生明顯改變[9]，其毒性與其粒徑，表面修飾和分布密切相關(guān)[5]。納米材料在理化性質(zhì)上的微弱差異可直接導(dǎo)致其安全窗和毒性靶器官的不同。因此安全性評價需強調(diào)納米材料的理化性質(zhì)鑒定。在開展毒性評價之前，可參考OECD ENV/JM/MONO(2016)2、ISO/TR 13014：2012、ISO/TC229等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，充分考察其物理化學(xué)性能和穩(wěn)定性[26-28]。對于理化性質(zhì)和穩(wěn)定性不同的相同納米材料，需要分別評價。如果擬評價受試物為醫(yī)用納米材料或者含納米材料產(chǎn)品，應(yīng)為可充分代表臨床試驗或上市后人擬用產(chǎn)品質(zhì)量和安全性的樣品。

受試物制備的總體原則是最大程度上模擬受試物與人體實際接觸的方式。分散介質(zhì)可影響聚集體的大小，從而影響受試物的沉降、聚集、細(xì)胞暴露、細(xì)胞毒性、劑量選擇和遺傳毒性試驗結(jié)果。單純的納米材料受試物，需充分考慮其分散性，選擇合適的介質(zhì)，確保分散均勻，減少團(tuán)聚。當(dāng)特殊金屬納米材料可能會釋放金屬離子的情況時，需考慮所釋放的金屬離子與分散介質(zhì)中離子的反應(yīng)，可能會影響結(jié)果的判斷。如納米銀會釋放帶正電荷的銀離子，在分散介質(zhì)，如氯化鈉(NaCl)中，當(dāng)銀離子的濃度足夠高時可與介質(zhì)中的氯離子形成氯化銀顆粒物。此時，應(yīng)采取相應(yīng)措施避免顆粒物形成，并充分評價非納米材料顆粒物對試驗體系和結(jié)果的影響。由于有些納米材料具有極強的吸附特性，特別是對蛋白成分的吸附。因此，在樣品制備時如采用含有機(jī)成分的生理介質(zhì)，應(yīng)充分評價納米材料對介質(zhì)中有機(jī)成分的吸附，及其對試驗體系和試驗結(jié)果解釋的影響。

表1 遺傳毒性試驗方法用于納米材料毒性評價的問題與優(yōu)化建議

3.2 體外遺傳毒性試驗方法的關(guān)注點[7]

體外納米材料遺傳毒性試驗可根據(jù)ICH S2(R1)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性試驗結(jié)果，選擇最高受試物處理濃度[12]。某些情況下可考慮增加濃度設(shè)置間隔，設(shè)置大于標(biāo)準(zhǔn)范圍(√√ 1100倍)并在無細(xì)胞毒的情況下開展試驗，以保證獲得較好的濃度-效應(yīng)關(guān)系。

為保證納米材料在體外實驗系統(tǒng)的生物和物理環(huán)境中的狀態(tài)與體內(nèi)應(yīng)用時的微環(huán)境的檢測結(jié)果有可比性，應(yīng)使用現(xiàn)有的方法對給藥處理開始和給藥處理結(jié)束的細(xì)胞培養(yǎng)基中納米材料的表征進(jìn)行鑒定。

考慮到納米材料可能區(qū)別于普通化合物，不會在肝臟經(jīng)過復(fù)雜的代謝過程，且S9作為高蛋白組分可影響納米材料與細(xì)胞的相互作用，含納米粒子受試物的體外研究通常不設(shè)置添加S9代謝活化的試驗條件。然而尚沒有數(shù)據(jù)明確指出在安全性評價可不設(shè)置S9處理組，該試驗條件是否有意義還有待進(jìn)一步考察。

納米材料細(xì)胞攝取程度也是解釋檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素，因此建議開展體外遺傳毒性試驗時同時對細(xì)胞攝取能力進(jìn)行分析。通常從直接遺傳毒性的角度分析，如哺乳動物對納米材料攝取能力有限，可提示為較低的內(nèi)在風(fēng)險。當(dāng)前細(xì)胞納米材料攝取水平的定量分析方法通常使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)的方法。細(xì)胞經(jīng)受試物處理后，反復(fù)經(jīng)PBS洗滌后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。如納米材料粘附于細(xì)胞表面，細(xì)胞外的納米材料難以沖洗干凈，則檢測結(jié)果可產(chǎn)生一定偏差。

3.3 體內(nèi)遺傳毒性試驗方法的關(guān)注點

考慮到動物實驗3R原則[替代(replacement)、減少(reduction)和優(yōu)化(refinement)]，體內(nèi)評價方法并非納米材料遺傳毒性評價的首選。然而體外試驗可能無法充分反應(yīng)體內(nèi)的條件，比如遺傳物質(zhì)損傷可能是刺激免疫系統(tǒng)炎癥反映而間接誘導(dǎo)遺傳毒性，尤其是納米材料介導(dǎo)的短期強炎癥反應(yīng)和慢性持續(xù)的炎癥反應(yīng)都值得引起關(guān)注。不過當(dāng)前評價免疫毒性的體外細(xì)胞因子釋放等方法與體內(nèi)評價方法的一致性尚未得到充分證明，與遺傳毒性有關(guān)的具體的炎癥或免疫作用通路并不明確，且炎癥、遺傳毒性和致癌性之間的關(guān)聯(lián)還有待深入了解[25]。故開展體內(nèi)研究應(yīng)基于一定的體外研究基礎(chǔ)。此外，開展體內(nèi)遺傳毒性研究前，需進(jìn)行一些毒代動力學(xué)研究以確定納米材料是否到達(dá)遺傳毒性非接觸部位靶組織。在缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)的情況下，如納米材料沒有到達(dá)靶組織，則相應(yīng)試驗方法不適用于檢測初級遺傳毒性。在給藥方式上，目前沒有足夠的數(shù)據(jù)支持某種給藥方式優(yōu)于另一種給藥方式。試驗給藥方式需根據(jù)人最常見的暴露途徑選擇[7]。

4 遺傳毒性試驗組合優(yōu)化的考慮

根據(jù)OECD遺傳毒性試驗方法評價指導(dǎo)原則，以及當(dāng)前文獻(xiàn)報道的納米材料遺傳毒性評價的特殊性，本課題組初步提出在對納米材料開展遺傳毒性評價時的試驗組合優(yōu)化的關(guān)注點。具體如圖1。

圖1 納米材料遺傳毒性試驗組合優(yōu)化方案

盡管當(dāng)前觀點認(rèn)為傳統(tǒng)Ames試驗不適用于納米材料遺傳毒性檢測，但Ames試驗作為對嚙齒類動物腫瘤發(fā)生率預(yù)測效果最好的遺傳毒性試驗方法，不應(yīng)完全排除在現(xiàn)階段納米材料遺傳毒性評價組合之外。應(yīng)在提供研究所用試驗條件下細(xì)菌對該納米材料攝取能力的基礎(chǔ)上，考慮是否選擇Ames試驗，或者作為Ames試驗結(jié)果判定的參考。而小鼠淋巴瘤tk基因突變試驗涵蓋了基因突變和染色體斷裂兩個檢測終點，可作為第2項納米材料潛在致突變能力檢測方法。體外微核試驗或體外染色體畸變試驗針對致斷裂劑在檢測終點上與Ames試驗和MLA互補，可任選一項作為第3項遺傳毒性評價方法。在提供相應(yīng)研究數(shù)據(jù)的同時應(yīng)提供研究所用試驗條件下細(xì)胞對該納米材料攝取能力的證據(jù)，作為試驗結(jié)果判定的參考。此外，納米材料的遺傳毒性試驗組合應(yīng)參考藥物遺傳毒性試驗包括一項體內(nèi)研究。可在嚙齒類動物紅細(xì)胞微核試驗、哺乳動物骨髓染色體畸變試驗或嚙齒類動物體內(nèi)彗星試驗中任選一項作為組合中的第4項試驗。

如體外研究中獲得陽性結(jié)果再根據(jù)出現(xiàn)陽性結(jié)果的遺傳毒性終點選擇相應(yīng)的體內(nèi)評價方法。如果4項遺傳毒性試驗結(jié)果均為陰性，且根據(jù)受試物毒性作用機(jī)制分析不存在潛在致遺傳毒性的風(fēng)險，則判斷受試物遺傳毒性結(jié)果為陰性，無需進(jìn)一步評價其遺傳毒性。如果在4項遺傳毒性試驗中至少一項研究結(jié)果為陽性，則判定遺傳毒性試驗結(jié)果為陽性，考慮受試物存在遺傳毒性風(fēng)險。可進(jìn)一步開展與檢出陽性結(jié)果的評價終點一致的體內(nèi)試驗，并針對靶器官(組織)進(jìn)行研究。

5 小結(jié)

納米材料的誕生為人類帶來機(jī)遇的同時也帶來了挑戰(zhàn)。與普通化合物相比，納米材料的遺傳毒性評價方法和試驗條件均有所差異。如何科學(xué)地評價納米材料的遺傳毒性，成為當(dāng)前亟需解決的問題。部分方法需要在傳統(tǒng)方法上進(jìn)行一定調(diào)整和優(yōu)化，而一些試驗及試驗條件，如體外細(xì)胞攝取能力評價方法的優(yōu)化、體外研究是否有必要添加S9和血清含量的選擇尚有待深入探索，另有一些尚不成熟的新方法或可通過一系列條件摸索和驗證工作成為適宜納米材料的評價方法。深入開展納米材料遺傳毒性評價方法標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化的工作，勢必將推進(jìn)一系列新興的遺傳毒性評價方法進(jìn)入安全評價領(lǐng)域。本文回顧了現(xiàn)有常用遺傳毒性評價方法用以評價納米材料的優(yōu)勢與劣勢，總結(jié)了納米材料遺傳毒性評價時的關(guān)注點，并基于OECD專家工作組的相關(guān)建議及相關(guān)遺傳毒性評價指導(dǎo)原則初步提出納米材料遺傳毒性試驗組合優(yōu)化方案，以填補相關(guān)領(lǐng)域的空白，為納米材料毒性評價和含納米材料產(chǎn)品技術(shù)審評工作提供有益的借鑒。