劉 丹 ，張 文，王心怡，陳 濤 ，胡 衛(wèi)*

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理/腫瘤科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜 昌 443002）

骨癌痛(cancer-induced bone pain，CIBP)是一種特殊的慢性疼痛且隨著疾病的進(jìn)展不斷增加，其產(chǎn)生是由原發(fā)性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至骨所致[1]。發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的患者通常起初無(wú)明顯癥狀，直到出現(xiàn)骨的疼痛或者骨骼相關(guān)并發(fā)癥(如骨質(zhì)破壞等)時(shí)才能被明確診斷，而在轉(zhuǎn)移晚期，這種疼痛很難治療，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。因此，我們?nèi)孕柽M(jìn)一步探索CIBP發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋求新的止痛劑及治療方案。

中醫(yī)藥治療CIBP有肯定的療效，以其升高痛閾，降低機(jī)體對(duì)不良刺激反應(yīng)程度，改變精神狀態(tài)來(lái)減輕痛苦，且使用安全、無(wú)成癮性和戒斷性，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于CIBP的各個(gè)階段[3]。其中，我國(guó)傳統(tǒng)的名貴藥材——蟾蜍，具有解毒、消腫、止痛、抗炎抗腫瘤等功效，在臨床上應(yīng)用非常廣泛，其全皮水提物華蟾素是我國(guó)自行研制的二類新藥[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)華蟾素可通過(guò)阿片受體與阿片肽結(jié)合后抑制神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)(substance P，SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)的表達(dá)，減少疼痛的傳遞抑制癌痛的發(fā)生和發(fā)展[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)華蟾素能使炎性疼痛模型大鼠的炎癥和疼痛明顯緩解且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，抑制炎癥介質(zhì)的釋放發(fā)揮其抗炎鎮(zhèn)痛作用可能是其鎮(zhèn)痛的機(jī)制之一[6]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討華蟾素是否能通過(guò)抑制CIBP大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化減少炎性介質(zhì)釋放而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

實(shí)驗(yàn)造模開(kāi)始前進(jìn)行大鼠機(jī)械痛與熱痛閾值的檢測(cè)，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)核實(shí)，確定正常大鼠機(jī)械痛閾值范圍為26.0～32.0 g、熱痛閾值范圍14.0～19.2 s，根據(jù)這個(gè)范圍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)大鼠篩選。測(cè)量的起始值都是從0開(kāi)始，篩出SPF級(jí)雌性(本實(shí)驗(yàn)選用的骨癌痛造模細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞，在雌性大鼠體內(nèi)傳代，選用雌性大鼠造模更合理)SD大鼠48只，體質(zhì)量160～180 g，由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2011-0012]。將大鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和華蟾素(安徽金蟾生化股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z34020274，規(guī)格為每支5 mL，貨號(hào)150723-25)干預(yù)組，每組12只，華蟾素干預(yù)組于造模第7天開(kāi)始腹腔注射華蟾素注射液(5 mL/kg，每天1次，連續(xù)8 d)，其余各組每天予以等量生理鹽水。

1.2 骨癌痛模型制備

取雌性幼鼠2只，體質(zhì)量60～80 g，腹腔注射乳腺癌Walker 256細(xì)胞0.5 mL(細(xì)胞濃度為4×107/mL)，接種第7天收集腹水，以無(wú)菌PBS(0.01 mol/L)漂洗細(xì)胞3次，細(xì)胞濃度調(diào)整至4×105/mL的濃度，置于冰上備用。模型組與華蟾素干預(yù)組大鼠麻醉后，仰臥固定于大鼠操作臺(tái)，備皮后碘伏消毒右側(cè)后肢脛骨處皮膚，于脛骨上段作l cm切口，暴露脛骨，在脛骨結(jié)節(jié)下0.5～l cm脛骨平臺(tái)上用1 mL注射器針頭垂直鉆孔至骨髓腔，待骨髓血液無(wú)明顯外流后，再用微量注射器將Walker 256細(xì)胞懸液0.01 mL緩慢注入骨髓腔，注射完畢后用醫(yī)用無(wú)菌骨蠟封住針孔，常規(guī)消毒傷口，局部給予少許青霉素后縫合傷口。假手術(shù)組操作與上述相同，用微量注射器注射0.01 mL PBS。

1.3 大鼠行為學(xué)檢測(cè)

分別于造模前、造模后第2、5、7、9、13、15天進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)(熱痛、機(jī)械痛)檢測(cè)。將大鼠置于底為網(wǎng)格的特制有機(jī)玻璃內(nèi)，待大鼠安靜后，將von Frey 2391 探針?lè)謩e刺激大鼠左右后足腳掌中部皮膚測(cè)定機(jī)械痛值，觀察大鼠縮足反應(yīng)并記錄大鼠的機(jī)械性閾值；大鼠置于底為光滑玻璃的有機(jī)玻璃格子內(nèi)，適應(yīng)一段時(shí)間后采用輻射熱測(cè)痛儀測(cè)熱痛值，將強(qiáng)熱光束分別照射大鼠左右后足腳掌中心皮膚，引起大鼠縮爪反應(yīng)時(shí)間為大鼠縮爪潛伏期，實(shí)驗(yàn)光源強(qiáng)度設(shè)定為35%，為防止大鼠燙傷，將上限值定為20 s。每只大鼠每個(gè)行為學(xué)測(cè)定3次，前后兩次間隔10 min，取平均值。

1.4 X-ray評(píng)估骨質(zhì)的破壞

在大鼠脛骨接種腫瘤細(xì)胞后，為了確定腫瘤生長(zhǎng)對(duì)骨質(zhì)的破壞，在造模后第7天將大鼠接種側(cè)和對(duì)照側(cè)后肢放在X光膠片(柯達(dá)公司，貨號(hào)XBT-1) 前，暴露在30 kVp強(qiáng)度的X射線下1 min，X光片在顯影劑(天津市漢中攝影材料廠，KonicaSRX-101)下顯影，進(jìn)行X線檢測(cè)。

1.5 免疫組化檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞活化情況

實(shí)驗(yàn)終末，大鼠麻醉后用多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取L4～L6段脊髓，30%蔗糖脫水后，冰凍冠狀切片，收集切片于0.01 mol/L PBS中，每個(gè)脊髓標(biāo)本分別選擇5張切片與小鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial filament acidic protein，GFAP)抗體(Abcam公司，1∶100稀釋)和兔小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記小鈣結(jié)合蛋白—鈣離子結(jié)合分子(ionized calcium-binding adaptor molecule，Iba-1)抗體(Abcam公司，1∶100稀釋)于4 ℃孵育12 h；依次加入生物素標(biāo)記的二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔/小鼠二抗)、親和素-生物素-過(guò)氧化物酶孵育后，以3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)呈色。顯色完成后將切片置于載玻片上，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，明膠封片，于光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)炎性因子表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)麻醉大鼠，切開(kāi)腹部，剝離腹主動(dòng)脈，采血針取血4～5 mL，靜置2 h后離心，取血清；冰上取出L4～L6段脊髓，勻漿后離心取上清液。按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行相關(guān)炎性因子(TNF-α和IL-1β)的檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。采用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)檢驗(yàn)(有重復(fù)測(cè)量資料方差分析、單因素方差分析)，兩組間的兩兩比較，方差齊時(shí)用LSD法；方差不齊時(shí)，用Dunnett T3法。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脛骨的影像學(xué)變化

大鼠脛骨X-ray結(jié)果顯示，在造模后第7天，正常對(duì)照組大鼠的骨質(zhì)完整，骨皮質(zhì)呈連續(xù)狀，邊界光滑、清晰，骨髓腔內(nèi)未見(jiàn)明顯異常(如圖1A)；假手術(shù)組骨質(zhì)些許缺損，骨皮質(zhì)呈連續(xù)狀，周圍骨組織未見(jiàn)明顯腫脹(如圖1B)；模型組大鼠明顯的骨質(zhì)破壞，同時(shí)骨皮質(zhì)有明顯的缺損，骨內(nèi)結(jié)構(gòu)不清晰，周圍骨組織明顯腫脹(如圖1C)。說(shuō)明骨癌痛大鼠造模成功。

圖1 大鼠脛骨的影像學(xué)變化

2.2 華蟾素對(duì)骨癌痛大鼠行為學(xué)的影響

大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠熱痛閾值、機(jī)械痛閾值均無(wú)明顯變化，模型組大鼠的熱痛閾值與機(jī)械痛閾值均明顯降低，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組相比，華蟾素干預(yù)后可顯著上調(diào)大鼠熱痛閾與機(jī)械痛閾值，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 華蟾素對(duì)骨癌痛大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

大鼠免疫組化結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白(GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白(Iba-1)含量均明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)；與模型組相比，華蟾素干預(yù)組大鼠脊髓GFAP和Iba-1蛋白表達(dá)均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 華蟾素對(duì)骨癌痛大鼠脊髓及血清中TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓及血清中TNF-α和IL-1β表達(dá)均明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)；與模型組相比，華蟾素干預(yù)組大鼠脊髓及血清中TNF-α和IL-1β濃度均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖2 華蟾素對(duì)骨癌痛大鼠行為學(xué)的影響

圖3 華蟾素對(duì)骨癌痛大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白Iba-1表達(dá)的影響(×400)

圖4 華蟾素對(duì)骨癌痛大鼠脊髓及血清中相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響

3 討論

CIBP是一種特殊的疼痛，與一般疼痛相似但又有其獨(dú)特的特征，主要包括腫瘤的生長(zhǎng)破壞骨組織引起的機(jī)能減弱，此外，其同時(shí)包含炎性疼痛及神經(jīng)病理性疼痛兩方面，被認(rèn)為是治療最困難的疼痛之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[7-8]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一些免疫功能細(xì)胞(主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)在慢性疼痛形成的病理機(jī)制中占有重要地位[9-10]。在CIBP中，可以發(fā)現(xiàn)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，激活的膠質(zhì)細(xì)胞主要是特定膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的上調(diào)或形態(tài)的改變，包括肥大、增生等。小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后，Iba-1表達(dá)上調(diào)[11]；激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)發(fā)生形態(tài)的改變(如細(xì)胞肥厚)、GFAP表達(dá)的增加，引起轉(zhuǎn)錄后的修飾，導(dǎo)致脊髓促炎物質(zhì)，包括TNF-α、IL-1β、ROS、興奮性氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)，增加神經(jīng)的興奮性，加重疼痛反應(yīng)[12-13]。而在CIBP大鼠中予以膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑，可有效降低一些細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β等)的表達(dá)，減輕大鼠的機(jī)械痛和熱痛，可以緩解或阻斷疼痛的發(fā)生和發(fā)展[14]。

華蟾素及其原藥材蟾蜍皮具有解毒散結(jié)、消腫止痛的功效，亦有文獻(xiàn)記載其具有扶正補(bǔ)虛，強(qiáng)心定痛之功效。對(duì)于癌痛“邪毒於結(jié)、本虛標(biāo)實(shí)”的病機(jī)特點(diǎn)，華蟾素既能清熱解毒、消腫散結(jié)以治其實(shí)，又能扶正以治其虛，因此控制癌痛方面表現(xiàn)出較好的療效。CIBP發(fā)病機(jī)制不同于單純的神經(jīng)病理性疼痛或炎性痛，它是神經(jīng)病理變化、炎性反應(yīng)和組織壞死等因素的綜合結(jié)果，從功效上分析，華蟾素能治療CIBP一方面是因?yàn)槠淠芮鍩峤舛疽韵字雇?，另一方面與其消腫散結(jié)以控制腫瘤生長(zhǎng)、減輕腫瘤周圍組織的腫脹壓迫而緩解神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)華蟾素能增加背根神經(jīng)節(jié)阿片受體表達(dá)發(fā)揮外周鎮(zhèn)痛，但其如何發(fā)揮消炎止痛的機(jī)制尚不清楚。為了進(jìn)一步探討華蟾素抗炎鎮(zhèn)痛的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠脛骨注射Walker 256細(xì)胞建立CIBP模型，造模后第7天脛骨X線顯示：模型組大鼠骨皮質(zhì)破壞明顯、骨質(zhì)連續(xù)性缺乏、骨組織腫脹明顯，對(duì)照組、假手術(shù)組未見(jiàn)明顯骨組織腫脹、骨連續(xù)性較好，說(shuō)明CIBP模型成功。行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明華蟾素可明顯緩解CIBP所誘發(fā)的機(jī)械痛敏、熱痛敏，而后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，華蟾素可抑制CIBP大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少脊髓膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)炎性介質(zhì)(TNF-α和IL-1β)的釋放，同時(shí)也可降低其釋放到血清中的TNF-α和IL-1β濃度。這些結(jié)果表明華蟾素對(duì)CIBP大鼠有較好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其機(jī)制之一可能是通過(guò)抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞活化、減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用的。