李 剛，秦樊鑫，張 盈，龍家寰，魏 進(jìn)*

(1.貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550006)

乙基多殺菌素(Spinetoram)原藥為其有效成分乙基多殺菌素-J(XDE-175-J)和乙基多殺菌素-L(XDE-175-L)的混合物(比例3∶1)，可作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，擾亂蟲體對(duì)信號(hào)的傳遞反應(yīng)，影響其正常的神經(jīng)活動(dòng)而致其死亡[1]。乙基多殺菌素為我國(guó)登記的可在甘藍(lán)、黃瓜、茄子、水稻、楊梅和豇豆上使用的農(nóng)藥。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763-2016)[2]規(guī)定，蔬菜類豇豆、結(jié)球甘藍(lán)和茄子中乙基多殺菌素的最大殘留限量分別為0.1、0.5、0.1 mg/kg；谷物類稻谷和糙米中最大殘留限量分別為0.5、0.2 mg/kg。《國(guó)際食品法典》規(guī)定番茄、甜橙和樹堅(jiān)果中乙基多殺菌素的最大殘留限量分別為0.06、0.07、0.01 mg/kg。洛黨參(RadixGotonopsicTongshenOtiv.)是貴州省地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，其肉質(zhì)鮮嫩，具有極高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但其生長(zhǎng)過程中易受病蟲害的侵?jǐn)_，影響產(chǎn)量和品質(zhì)。乙基多殺菌素作為一種高效、低毒、易降解的新型農(nóng)藥[3]，可用于防治蚜蟲對(duì)洛黨參產(chǎn)生的危害，但使用不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致該藥殘留并威脅人體健康。關(guān)于乙基多殺菌素殘留分析所涉及的基質(zhì)包括土壤、水稻、水果等，但未見該藥在洛黨參中的殘留分析報(bào)道和限量規(guī)定，因而建立洛黨參中乙基多殺菌素殘留的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

目前，乙基多殺菌素殘留的檢測(cè)方法有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-5]。Park等[6]通過QuEChERS法提取，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，研究了莧屬植物和歐芹中乙基多殺菌素原藥及其代謝組分的殘留情況。Malhat等[7]將QuEChERS法和高效液相色譜聯(lián)用，進(jìn)行了乙基多殺菌素在番茄中的殘留檢測(cè)研究。陳國(guó)等[8]通過QuEChERS法提取凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，研究了乙基多殺菌素在稻田水、土壤及水稻植株中的殘留及消解動(dòng)態(tài)。劉賽等[9]通過乙腈超聲提取，0.22 μm濾膜凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，研究了乙基多殺菌素在寧夏枸杞中的消解動(dòng)態(tài)。吳瓊等[10]通過乙腈-5%氯化鈉溶液-1 mol/L氫氧化鉀溶液提取，固相萃取柱凈化，超高效液相色譜檢測(cè)，研究了土壤中乙基多殺菌素的殘留，但該實(shí)驗(yàn)存在樣品前處理復(fù)雜和乙腈用量多等問題。QuEChERS法高效、穩(wěn)定、快捷，有機(jī)溶劑用量少，更適于樣品農(nóng)殘檢測(cè)的前處理；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)具有檢出限低、靈敏度高和檢測(cè)耗時(shí)短等特點(diǎn)，被廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的分析測(cè)定。為快速檢測(cè)洛黨參中的乙基多殺菌素殘留量，本研究采用QuEChERS法進(jìn)行樣品前處理，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，建立了洛黨參中乙基多殺菌素殘留量的分析方法，為洛黨參的質(zhì)量控制和乙基多殺菌素的安全使用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000/TSQ VANTAGE UHPLC-MS/MS(ThermoFisher公司)；TG 16離心機(jī)(長(zhǎng)沙邁森儀器公司)；勻漿機(jī)(江蘇中大儀器廠)；SK-1旋渦混合器(海門市其林貝爾公司)；BSA224S-CW電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器公司)；CK2000高通量組織研磨儀(北京托摩根生物科技有限公司)。

乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%，德國(guó)Dr.Ehrensorfer公司)；無水硫酸鎂、氯化鈉、乙腈(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，默克公司)；甲酸(88%，ThermoFisher公司);蒸餾水(屈臣氏)；Filter Unit 濾膜(0.22 μm)、石墨化碳(GCB)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)購自Agela Teachnolopies 公司；C18、多壁碳納米管(MWCNTs)購自北京博宇高科新材料技術(shù)有限公司。

洛黨參：采自貴州省遵義市道真縣洛黨參種植基地。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取0.010 5 g乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得到100 mg/L的乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃下保存。準(zhǔn)確移取適量?jī)?chǔ)備液，分別用乙腈、洛黨參空白稀釋成含XDE-175-J質(zhì)量濃度為0.075、0.375、0.75、3.75、7.5、75 μg/L和含XDE-175-L質(zhì)量濃度為0.025、0.125、0.25、1.25、2.5、25 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。在“1.2.3”條件下進(jìn)樣，以峰面積(y)對(duì)乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x,μg/L)作圖，通過最小二乘法擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.2提取與凈化提?。簻?zhǔn)確稱取洛黨參樣品10 g于50 mL離心管中，加入5 mL 超純水，待樣品完全潤(rùn)濕后，加入10 mL乙腈,以1 000 r/min 振蕩提取10 min，室溫下靜置30 min，加入2 g 氯化鈉和3 g 無水硫酸鎂，振蕩10 min，以5 000 r/min離心5 min。

凈化：移取1.5 mL上清液于裝有30 mg PSA+10 mg GCB+150 mg 無水硫酸鎂的2 mL 離心管中，渦旋1 min，以6 000 r/min離心10 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜后于進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.2.3儀器條件液相色譜條件：色譜柱：Syncronis C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，ThermoFisher公司)；二元梯度洗脫分離，流動(dòng)相：0.1% 甲酸(A)-乙腈(B)；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL。梯度洗脫條件：0～1 min，25%A；1～1.5 min，25%～85%A；1.5～5 min，85%A；5～6 min，85%～25%A；6～ 7 min，25%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子電離(ESI+)；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣、輔助氣為氮?dú)猓蕷鈮毫?0 Arb(2 068.5 kPa)，輔助氣壓力10 Arb(689.5 kPa)；電噴霧電壓：正離子源3 500 V；碰撞保護(hù)氣為氬氣，1.5 mTorr(2 Pa)；檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，待測(cè)組分的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 乙基多殺菌素的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters of spinetoram

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇

在XDE-175-J和XDE-175-L加標(biāo)水平分別為37.5 μg/kg和12.5 μg/kg的條件下，用甲酸-乙腈和乙腈分別進(jìn)行乙基多殺菌素的提取。發(fā)現(xiàn)兩者均能得到良好的提取效果，回收率分別為110.0%～115.3%和105.8%～109.7%，但甲酸-乙腈作為提取劑時(shí)，樣品的平行性較差，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)相對(duì)較高(20%)，而以乙腈為提取劑時(shí)RSD<3%。因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為提取劑。

2.2 凈化劑的選擇

在XDE-175-J和XDE-175-L加標(biāo)水平分別為3.75 μg/kg和1.25 μg/kg的條件下，考察了不同凈化劑的凈化效果(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以30 mg PSA+ 10 mg GCB作為凈化劑組合能得到最優(yōu)回收率和RSD。這是由于PSA能夠去除洛黨參中的有機(jī)酸、脂肪酸和極性雜質(zhì)[11]；GCB能夠有效去除色素干擾[12]。因此實(shí)驗(yàn)以30 mg PSA+ 10 mg GCB為凈化劑。

表2 不同凈化劑種類的影響Table 2 Effects of different types of purifying agents

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)效應(yīng)

按照“1.2.1”方法得到乙基多殺菌素的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(J為XDE-175-J,L為XDE-175-L)為：yJ=4.353×106x-962(r2=0.999 6)，yL=1.895×106x+1 310(r2=0.999 6)；基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：yJ=4.516×106x+4 166(r2=0.999 4)，yL=1.978×106x+2 731(r2=0.998 9)；表明在系列濃度范圍內(nèi)，乙基多殺菌素的峰面積與溶液濃度的線性關(guān)系良好[13]。乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1A。

圖1 乙基多殺菌素在洛黨參中的色譜圖Fig.1 Chromatograms of spinetoram in Radix Gotonopsic Tongshen OtivA.spinetoram standard(1.875 μg/L for XDE-175-J;0.625 μg/L for XDE-175-L);B.blank sample;C.Radix Gotonopsic Tongshen Otiv.spikeded with 0.375 μg/kg for XDE-175-J and 0.125 μg/kg for XDE-175-L;D.actual Radix Gotonopsic Tongshen Otiv.sample

基質(zhì)效應(yīng)指樣品中被分析物以外的共流出組分對(duì)分析物的響應(yīng)值有干擾，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[14]。可通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比(γ，%)來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)90%<γ<110%時(shí)，表示基質(zhì)效應(yīng)不顯著，γ>110%時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，γ<90%時(shí)為基質(zhì)減弱效應(yīng)[15]。本方法中XDE-175-J和XDE-175-L的γ分別為103.7%和104.4%，表明基質(zhì)效應(yīng)不顯著，可忽略不計(jì)。

2.4 方法的準(zhǔn)確度、精密度與靈敏度

表3 乙基多殺菌素在洛黨參中的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of spinetoram in Radix Gotonopsic Tongshen Otiv.

稱取10 g空白的洛黨參樣品，加入一定量乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品，其中XDE-175-J的加標(biāo)水平分別為0.375、3.75、75 μg/kg，XDE-175-L的加標(biāo)水平分別為0.125、1.25、25 μg/kg。對(duì)其進(jìn)行樣品前處理后測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果見表3。由表3可知，在加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，XDE-175-J 的平均回收率為88.4%～113.5%，RSD為2.0%～4.2%；XDE-175-L 的平均回收率為84.4%～99.5%，RSD為2.5%～4.9%，方法顯示了良好的準(zhǔn)確性和精密度，符合《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求[16]。其中在對(duì)照區(qū)中采集的樣品空白的色譜圖見圖1B；乙基多殺菌素加標(biāo)色譜圖見圖1C。

定量下限(LOQ)指用加標(biāo)方法能檢測(cè)出待測(cè)物在樣品中的最低含量[16]。由于乙基多殺菌素在光照下易分解，因而對(duì)其殘留進(jìn)行測(cè)定時(shí)，要求儀器具有較高的靈敏度和較低的檢出限[10]。參照文獻(xiàn)[17]，以最小加標(biāo)濃度確定乙基多殺菌素在洛黨參中的定量下限(LOQ)為：0.375 μg/kg(XDE-175-J)和0.125 μg/kg(XDE-175-L)，表明方法的靈敏度良好，可滿足農(nóng)藥殘留靈敏檢測(cè)的要求。傅強(qiáng)等[18]通過乙腈提取水稻植株、谷殼和糙米，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，得到XDE-175-J和XDE-175-L的定量下限(LOQ)分別為0.016、0.004 mg/kg；陳國(guó)等[8]通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，得到乙基多殺菌素在稻田水、土壤、水稻植株中的定量下限(LOQ)分別為0.001 mg/L、0.002 mg/kg、0.005 mg/kg。本方法的定量下限明顯低于上述研究。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

為驗(yàn)證方法的實(shí)用性，對(duì)市售12份洛黨參樣品按照“1.2.2”方法進(jìn)行前處理，在“1.2.3”條件下檢測(cè)，其中2份洛黨參樣品中檢出乙基多殺菌素殘留，但含量小于本方法的定量下限和該藥在豇豆和茄子(0.1 mg/kg)、結(jié)球甘藍(lán)(0.5 mg/kg)中的最大殘留限量值(MRL)。實(shí)際樣品色譜圖見圖1D。

3 結(jié) 論

本文建立了洛黨參中乙基多殺菌素殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)快速檢測(cè)方法，本方法樣品前處理簡(jiǎn)單、易操作，定量檢測(cè)用時(shí)短，檢出限和定量下限低，靈敏度高，滿足農(nóng)藥殘留分析相關(guān)要求和色譜分析的規(guī)定，可用于洛黨參中乙基多殺菌素殘留的快速測(cè)定。