周秀錦，楊會成，邵宏宏，張 靜，相興偉，韓 超，鄭 斌

(1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316000;3.溫州出入境檢驗檢疫局，浙江 溫州 325000)

二甲苯是有機(jī)化工的重要原料，廣泛應(yīng)用于涂料、橡膠、醫(yī)藥和農(nóng)藥等多個行業(yè)，美國政府工業(yè)衛(wèi)生學(xué)家會議(ACGIH)[1]將其歸類為A4級，屬于低毒類化學(xué)物質(zhì)。國內(nèi)外因二甲苯引發(fā)的急、慢性中毒案件時有發(fā)生，主要與攝入含有二甲苯的物質(zhì)以及生活、工作環(huán)境中接觸二甲苯有關(guān)[2-4]。二甲苯的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[5-7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8-10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[11-12]等，但研究對象大多為大氣、海水[13]、底泥沉積物[14]、尿液和血液[15-18]等基質(zhì)。前處理方法有固液萃取、頂空進(jìn)樣、固相微萃取和吹掃捕集等，其中固液萃取操作繁瑣、樣品前處理時間較長、易造成二甲苯損失且重現(xiàn)性差；固相微萃取因樣品用量小、方便靈活而成為目前的研究熱點，但設(shè)備和耗材相對昂貴限制了其普及性；吹掃捕集雖可解決二甲苯損失的問題，但與之相比，動態(tài)頂空進(jìn)樣更為簡單、快速，且在分析過程中不易引入溶劑、基質(zhì)干擾小，常作為揮發(fā)物的前處理方式。目前尚未見GC-MS/MS法測定海產(chǎn)品中二甲苯的研究報道，本文采用直接動態(tài)頂空技術(shù)與GC-MS/MS相結(jié)合的方法，建立了一種海產(chǎn)品中二甲苯3種同分異構(gòu)體的HS/GC-MS/MS檢測方法，并應(yīng)用于東海區(qū)域海產(chǎn)品中二甲苯的分析檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ8040氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、AOC-5000 plus頂空進(jìn)樣器(日本島津公司)；20 mL頂空進(jìn)樣瓶；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；XS105電子天平(瑞士Metler-Toledo公司)；GM300研磨儀(德國Retsch公司)；OGS100烘箱(美國熱電公司)。

鄰二甲苯(o-Xylene，OX；批號261947；純度99.5%)、對二甲苯(p-Xylene，PX，批號253439；純度99.9%)、間二甲苯(m-Xylene，MX；批號261948；純度99.8%)標(biāo)準(zhǔn)溶液均購自美國o2si公司。NaCl為優(yōu)級純，500 ℃灼燒2 h，置于干燥器內(nèi)備用；實驗用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與試樣制備

用水配制3種二甲苯的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，質(zhì)量濃度均為10.0 mg/L，置于4 ℃冰箱避光保存。

取代表性海產(chǎn)品樣品約500 g，用GM300研磨儀充分搗碎均勻，裝入潔凈容器中，密封，于-18 ℃以下冷凍存放。

1.3 樣品前處理

取潔凈的20 mL頂空進(jìn)樣瓶于烘箱內(nèi)，130 ℃烘烤30 min，冷卻后加入2.0 g NaCl備用。準(zhǔn)確稱取樣品2.0 g于裝有NaCl的頂空進(jìn)樣瓶中，加入8.0 mL水，迅速密封，旋渦30 s充分混勻，超聲5 min后，待測。

1.4 氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1頂空條件頂空進(jìn)樣系統(tǒng)采用高速振蕩模式，頂空瓶平衡溫度：90 ℃；平衡時間：40 min；進(jìn)樣方式：頂空進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 mL。

1.4.2氣相色譜條件色譜柱：HP-INNOWax(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至100 ℃，保持2 min；再以40 ℃/min升至200 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：220 ℃，進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣(分流比10∶1)；載氣：氦氣；載氣控制方式：線速度36.1 cm/s。

1.4.3質(zhì)譜條件離子化方式：EI；離子源溫度：230 ℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度：280 ℃；檢測器電壓：調(diào)諧電壓+0.1 kV；電子能量70 eV；掃描開始時間5.01 min，結(jié)束時間19.80 min；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；掃描間隔0.3 s；溶劑延遲時間為7 min。優(yōu)化后的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 3種二甲苯同分異構(gòu)體的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and MS parameters of three xylene isomers

*quantitative ion pair

1.5 基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

取與待測樣品基質(zhì)相同的空白樣品2.0 g，加入適量的二甲苯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”和“1.4”方法檢測后，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

NaCl會降低苯系物在水中的溶解度，提高樣品中苯系物的離子強(qiáng)度，增強(qiáng)其檢測信號[19-20]。本實驗針對基質(zhì)相對復(fù)雜的黃魚樣品，分別加入0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g的NaCl，其他步驟按照“1.3”和“1.4”進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分析靈敏度隨著NaCl添加量的增加而提高。當(dāng)NaCl添加量為2.0 g時，PX、MX和OX的靈敏度最大，響應(yīng)值分別比未加NaCl時提高了17.9%、16.8%和18.5%；當(dāng)NaCl添加量高于2.0 g時，二甲苯響應(yīng)值變化不明顯。同時對超聲時間進(jìn)行了優(yōu)化，將2.0 g黃魚樣品分別超聲0、3、5、7、10 min，其他步驟按照“1.3”和“1.4”進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分析靈敏度隨著超聲時間的延長而提高。當(dāng)超聲時間為5 min時，PX、MX和OX的靈敏度最大，響應(yīng)值分別比未超聲時提高了5.0%、6.3%和5.7%；當(dāng)超聲時間大于5 min時，響應(yīng)值變化不明顯。故本實驗選擇NaCl的添加量為2.0 g，超聲時間5.0 min。

2.2 頂空進(jìn)樣平衡溫度與平衡時間的選擇

采用空白黃魚樣品，添加3種二甲苯混合標(biāo)液，使其最終含量均為20.0 μg/kg，對頂空進(jìn)樣平衡溫度進(jìn)行優(yōu)化。平衡時間設(shè)為40 min，考察了平衡溫度(60、70、80、90、95 ℃)的影響，按實驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，在60～90 ℃范圍內(nèi)，隨著平衡溫度的升高，3種二甲苯同分異構(gòu)體的峰面積明顯增加，而平衡溫度為95 ℃時，峰面積則無明顯增加。另外，由于提取溶劑水的沸點為100 ℃，若平衡溫度過高，頂空瓶承受的壓力更大，存在安全隱患。因此，實驗選擇頂空進(jìn)樣平衡溫度為90 ℃。

以水為提取溶劑，對頂空進(jìn)樣平衡時間進(jìn)行優(yōu)化。將平衡溫度設(shè)為90 ℃，考察了平衡時間分別為35、40、45 min的效果，按實驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，在35～40 min范圍內(nèi)，隨著平衡時間的延長，3種二甲苯同分異構(gòu)體的峰面積顯著增加，而平衡時間增至40～45 min時，峰面積無明顯增加。推測平衡時間為40 min時，頂空進(jìn)樣瓶中待測物氣-液兩相已達(dá)平衡。若平衡時間過長，可能會引起頂空進(jìn)樣瓶的氣密性變差，導(dǎo)致檢測結(jié)果的誤差增大。因此，選擇頂空進(jìn)樣平衡時間為40 min。

2.3 升溫方式的選擇

由于待測物鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯為同分異構(gòu)體，沸點均在138.4～144.4 ℃之間，且極性較接近，主要碎片離子相同，因此氣相色譜選擇程序升溫以更好地對其進(jìn)行分離。初始溫度設(shè)為60 ℃，保持6 min，然后以10 ℃/min升溫至150 ℃，使沸點低、極性較小的成分先流出，最后以30 ℃/min升溫至260 ℃，實現(xiàn)了3種二甲苯同分異構(gòu)體的充分分離，同時避免了魚類和貝類樣品復(fù)雜基質(zhì)的干擾。

2.4 色譜柱的選擇

參考SN/T 2251-2009標(biāo)準(zhǔn)[21]中推薦的兩種色譜柱HP-50+和DB-5MS，本實驗比較了HP-50+、DB-5MS、Rxi-5Sil MS和HP-INNOWax 4種色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，間二甲苯和對二甲苯在HP-50+和DB-5MS色譜柱上不能分離；Rxi-5Sil MS柱雖耐水性較好，但對間二甲苯和對二甲苯的分離效果也不理想，且當(dāng)兩者濃度較高時，色譜峰部分重疊；而HP-INNOWax色譜柱的極性較強(qiáng)，在低溫狀態(tài)下，可完全實現(xiàn)間二甲苯和對二甲苯的分離，且分離度大于1.5，無基質(zhì)干擾。因此，實驗選用HP-INNOWax為本方法的色譜柱。

圖1 3種二甲苯同分異構(gòu)體在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 3 xylene isomers under multiple reaction monitoring mode

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在選定的色譜條件下，首先用Q3 SCAN全掃描方式得到鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯的總離子流色譜圖，選擇m/z和相對豐度較高的一級碎片為目標(biāo)化合物的母離子，同時確定其保留時間。再根據(jù)已確定的母離子，進(jìn)行不同碰撞能量(CE)的Product ion模式測定，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量和離子對，以保證檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。在表1的質(zhì)譜優(yōu)化條件下，3種二甲苯同分異構(gòu)體的MRM總離子流色譜圖見圖1，三者得到了較好分離。

2.6 線性范圍、精密度與檢出限

在優(yōu)化條件下，采用黃魚樣品基質(zhì)加標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以峰面積對相應(yīng)質(zhì)量濃度做回歸分析，3種二甲苯同分異構(gòu)體(MX，PX，OX)均在5.0～100.0 μg/kg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.991、0.994、0.995；以3倍信噪比為基準(zhǔn)，得到3種化合物的方法檢出限(LOD)均為2.5 μg/kg，以10倍信噪比為基準(zhǔn)，得到方法定量下限(LOQ)均為5.0 μg/kg。

為驗證方法的準(zhǔn)確度，對典型海產(chǎn)品如黃魚、南美白對蝦、貽貝和蟹樣品進(jìn)行了6.0、15.0、50.0 μg/kg 3個不同水平的二甲苯同分異構(gòu)體加標(biāo)回收實驗，按“1.3”和“1.4”條件處理，每一水平平行測定7次，計算得平均回收率為89.6%～112.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于11.5%(見表2)。

表2 二甲苯同分異構(gòu)體的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Average recoveries and relative standard deviations of xylene isomers

圖2 花蛤陽性樣品的總離子流譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of a positive clam sample

2.7 實際樣品的測定

在優(yōu)化條件下，采用本方法檢測了舟山地區(qū)南美白對蝦、黃魚、貝殼類、蟹等各類海產(chǎn)品共32個樣品。結(jié)果顯示，4批海產(chǎn)品中檢出對二甲苯，檢出量分別為7.85、12.40、8.21、7.89 μg/kg；鄰二甲苯和間二甲苯均未檢出。由此可見，對二甲苯對部分海產(chǎn)品造成了一定污染，其主要污染源可能來自附近煉油廠的重整工藝。圖2為花蛤陽性樣品的總離子流色譜圖。

3 結(jié) 論

本文建立了海產(chǎn)品中3種二甲苯同分異構(gòu)體的頂空/氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，方法的線性范圍、靈敏度、檢出限和回收率等技術(shù)指標(biāo)均滿足要求。3種二甲苯同分異構(gòu)體的加標(biāo)回收率為89.6%～112.4%，RSD不大于11.5%。應(yīng)用本方法對浙江舟山地區(qū)的海產(chǎn)品進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)4批海產(chǎn)品中檢出對二甲苯，表明部分海產(chǎn)品已受到一定程度的污染，應(yīng)引起廣泛的關(guān)注。本方法的檢測結(jié)果表明有必要定期對海產(chǎn)品中二甲苯引起的潛在風(fēng)險進(jìn)行評估。相關(guān)研究初步為海產(chǎn)品中二甲苯的監(jiān)測和預(yù)警提供了依據(jù)。