莫俊鑾 張麗君 周繼昌 龔春梅 徐遠(yuǎn)飛 楊慧

518020深圳市慢性病防治中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是慢性復(fù)發(fā)性皮膚病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究認(rèn)為，異常免疫反應(yīng)是其發(fā)病機(jī)制之一，而免疫調(diào)節(jié)失衡在AD疾病進(jìn)展中起重要作用。硒（selenium，Se）是人體必需的微量元素，它在減輕氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞功能，以及改善免疫狀態(tài)和抗炎作用方面發(fā)揮作用［1］。我們將AD免疫學(xué)特點(diǎn)和硒生物學(xué)功能結(jié)合，設(shè)計(jì)膳食硒干預(yù)二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB）致敏誘導(dǎo)的AD樣小鼠實(shí)驗(yàn)，觀察膳食硒水平對小鼠AD樣表現(xiàn)的影響。

材料和方法

一、材料

40只SPF級BALB/c小鼠來自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號44007200001631、44007200001820，許可證號SCXK（粵）2008-0002，3周齡，雌性，體重（10±1）g。硒飼料來自美國Harland Teklad公司，硒含量分別為0.01、0.25和3.00 mg/kg。DNCB來自美國Sigma公司。鼠IgE ELISA試劑盒來自中國臺灣Abnova公司。Multiskan FC酶標(biāo)儀來自美國Thermo公司。7700 X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀來自美國Agilent公司。

二、方法

1.膳食硒干預(yù)和致敏刺激動物實(shí)驗(yàn)：40只小鼠隨機(jī)分為缺硒組（日糧硒含量0.01 mg/kg）、正常硒組（0.25 mg/kg）、過量硒組（3.00 mg/kg）和對照組（0.25 mg/kg）［2］。所有小鼠先缺硒飼料飼養(yǎng)4周，再分別以缺硒、正常硒、過量硒和正常硒飼料喂養(yǎng)4周。隨后對缺硒、正常硒和過量硒組用致敏原（DNCB橄欖油丙酮溶液）激發(fā)AD樣表現(xiàn)，對照組用空白基質(zhì)溶液涂抹。激發(fā)方法在參照文獻(xiàn)［3］基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化：激發(fā)前24 h剃掉小鼠背部毛發(fā)（6～8 cm2面積），觀察24 h內(nèi)剃毛部位有無皮損和炎癥發(fā)生。按4∶1配制橄欖油和丙酮混合溶液，以此為基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為1%和0.1%的DNCB致敏溶液。前3天每天用200 μl的1%DNCB溶液涂擦DNCB組小鼠背部皮膚1次，第4天開始用0.1%DNCB涂抹背部皮膚，每周3次，共激發(fā)3周。對照組使用基質(zhì)液，頻率同致敏組。激發(fā)期間繼續(xù)按方案干預(yù)膳食硒水平。

2.小鼠皮炎表現(xiàn)監(jiān)測：每天觀察小鼠一般健康狀況和進(jìn)食情況，每次涂液前觀察皮膚變化并拍照。根據(jù)以下4類表現(xiàn)評價(jià)皮炎嚴(yán)重程度［4］：出血/紅斑，瘢痕/干燥，水腫，表皮脫落/侵蝕和苔蘚樣變。每種表現(xiàn)按照0（無）、1（輕度）、2（中度）和3（嚴(yán)重）評分，合計(jì)表現(xiàn)總評分。小鼠抓撓計(jì)數(shù)：在每次涂液1 h后，單獨(dú)放置小鼠，觀察小鼠5 min內(nèi)搔抓耳部或背部的動作（不含小鼠擦嘴、舔毛的動作），使用機(jī)械按壓式計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，連續(xù)搔抓按1次計(jì)數(shù)［3，5］。

3.免疫、組織病理和理化分析：激發(fā)3周后，眼眶采血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管收集后4℃保存待檢，1 h內(nèi)上機(jī)（血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）分析全血炎癥細(xì)胞。將上述EDTA抗凝血于4℃下1000×g離心15min獲得血漿，ELISA法檢測總IgE。脫頸處死小鼠，剪取小鼠背部實(shí)驗(yàn)部位皮膚，制備皮膚病理切片于顯微鏡下觀察。每只小鼠選擇4個(gè)切片，每個(gè)切片隨機(jī)選擇4個(gè)視野（×400）計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞，結(jié)果取均值。稱取0.3～0.5 g皮膚組織，采用ICP-MS（電感耦合等離子體質(zhì)譜）技術(shù)測定硒含量。

4.統(tǒng)計(jì)分析：IgE、硒水平和細(xì)胞計(jì)數(shù)等檢測結(jié)果多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用T檢驗(yàn)；IgE等檢測指標(biāo)與硒水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析和線性回歸分析；數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同組小鼠皮膚表現(xiàn)比較

1.皮膚表現(xiàn)：致敏組（缺硒、正常硒和過量硒）小鼠在激發(fā)1周后均先后出現(xiàn)紅斑、水腫、干燥、脫屑和苔蘚樣變，繼而在撓抓部位出現(xiàn)丘疹、糜爛和結(jié)痂等皮炎表現(xiàn)。早期表現(xiàn)首先出現(xiàn)于缺硒組，而后依次是正常硒組和過量硒組，但后期皮損炎癥在過量硒組最重，其次是正常硒組和缺硒組。致敏后期，過量硒組背部皮膚普遍出現(xiàn)因撓抓、撕咬導(dǎo)致的皮膚糜爛、出血和結(jié)痂情況。對照組皮膚無明顯變化。見圖1。

2.皮膚表現(xiàn)評分和抓撓次數(shù)：皮膚表現(xiàn)評分顯示，致敏第6天后，致敏組（缺硒、正常硒、過量硒）小鼠皮炎表現(xiàn)嚴(yán)重程度明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（致敏第6、8、11、13、15、18天時(shí)各組間比較，F(xiàn)值分別為44.897、76.622、114.866、33.352、28.605、11.271，均P＜ 0.01），見圖2A。致敏第11、13、15、18天時(shí)，過量硒組皮膚表現(xiàn)評分高于缺硒組和正常硒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），缺硒組和正常硒組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。致敏第8天，致敏組小鼠抓撓次數(shù)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（致敏第8、11、13、15、18天時(shí)各組間比較，F(xiàn)值分別為4.037、5.967、7.036、5.004、10.818，均P＜0.05）。致敏第13天，抓撓次數(shù)缺硒組＞正常硒組＞過量硒組，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2B。

圖1 各組小鼠皮膚表現(xiàn)變化

圖2 小鼠皮炎表現(xiàn)嚴(yán)重程度評分和瘙癢的變化

二、皮損組織病理觀察

1.病理表現(xiàn)：致敏小鼠表皮明顯增厚，棘層細(xì)胞大量增生，并向外突起；皮膚結(jié)構(gòu)分層不清晰，伴海綿水腫和結(jié)締組織膠原變性，常見血管擴(kuò)張充血和毛囊結(jié)構(gòu)消失等改變。對照組小鼠皮膚正常（圖3）。

2.皮膚組織中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)：見表1。皮膚組織中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在4組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05），其中3個(gè)致敏組均顯著高于對照組，但3個(gè)致敏組之間炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、全血炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)

致敏組全血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞水平隨硒水平增加而升高，見表1。其中過量硒組升高最明顯，缺硒組最低。

四、血漿總IgE檢測

見表1。與對照組相比，致敏組小鼠血漿總IgE均升高，且IgE水平隨膳食硒水平的增加而升高，其中過量硒組升高最顯著，與缺硒組、正常硒組和對照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為3.919、3.222、6.485，均P＜ 0.05）。

五、皮炎相關(guān)檢測指標(biāo)與硒水平相關(guān)性分析

1.皮膚組織硒含量：如表1所示，小鼠皮損/涂液處皮膚組織硒含量隨膳食硒水平增加而升高，各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.致敏小鼠主要檢測指標(biāo)與皮膚組織硒含量的相關(guān)性：Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，除全血單核細(xì)胞（r=0.289，P＞0.05）外，皮膚組織硒含量與血漿IgE水平（r=0.579，P=0.001）、全血白細(xì)胞（r=0.414，P=0.016）、中性粒細(xì)胞（r=0.439，P=0.011）、淋巴細(xì)胞（r=0.417，P=0.015）、嗜酸性粒細(xì)胞（r=0.505，P=0.004）和嗜堿性粒細(xì)胞（r=0.37，P=0.029）顯著相關(guān)。線性回歸分析顯示，除全血嗜堿性粒細(xì)胞（P＞0.05）和單核細(xì)胞（P＞0.05）外，其他指標(biāo)均與皮膚組織硒含量呈線性正相關(guān)（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠皮損組織病理（HE×40）

表1 各組小鼠皮膚組織硒含量及炎癥指標(biāo)檢測結(jié)果（±s）

表1 各組小鼠皮膚組織硒含量及炎癥指標(biāo)檢測結(jié)果（±s）

注：a與其他各組分別比較，均P＜0.05；b～e標(biāo)記相同字母的兩組之間同一指標(biāo)比較，P＜0.05；f小鼠背部皮損或?qū)φ詹课黄つw組織病理切片細(xì)胞計(jì)數(shù)，為4個(gè)隨機(jī)視野（400倍）均值

檢測項(xiàng)目皮膚組織硒含量（μg/kg）血漿總IgE（μg/L）皮膚淋巴細(xì)胞f（個(gè)/視野）皮膚中性粒細(xì)胞f（個(gè)/視野）皮膚嗜酸性粒細(xì)胞f（個(gè)/視野）全血白細(xì)胞（109/L）全血中性粒細(xì)胞（109/L）全血淋巴細(xì)胞（109/L）全血嗜酸性粒細(xì)胞（109/L）全血嗜堿性粒細(xì)胞（109/L）全血單核細(xì)胞（109/L）缺硒組（10只）65.56±13.1a 124.78±5.32 0.95±0.45b 2.05±0.97 2.30±1.59 3.03±0.97b c 0.12±0.05b c 2.07±0.58b c 0.12±0.13b 0.67±0.37b 0.05±0.07正常硒組（10只）200.80±51.6 132.61±4.71 1.65±0.42b 5.30±3.82b 3.10±2.02 4.58±0.95b d 0.19±0.05b d 3.78±0.87b d 0.17±0.12c 0.34±0.10b c 0.09±0.09過量硒組（10只）320.70±83.0a 167.17±8.49a 1.50±0.43 6.40±3.56b 4.15±2.00 9.20±5.89c e 0.45±0.33c e 6.71±4.28c e 0.63±0.46b c 1.22±0.84c 0.20±0.26對照組（10只）167.10±24.9 109.13±0.79a 0.05±0.11a 0.25±0.18a 0.00±0.00a 2.73±1.08d e 0.13±0.05d e 2.33±0.99d e 0.01±0.01a 0.20±0.08a 0.05±0.06 F值42.146 17.267 18.225 5.742 5.839 8.946 7.908 8.379 10.946 9.090 2.032 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

討 論

本實(shí)驗(yàn)中致敏小鼠均出現(xiàn)典型皮炎表現(xiàn)，其中缺硒組表現(xiàn)出現(xiàn)最早，但皮損程度最輕，過量硒組表現(xiàn)出現(xiàn)最晚，卻是皮損最嚴(yán)重的一組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，致敏小鼠血漿總IgE水平和全血炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)均隨膳食硒水平的增加而升高并與小鼠皮膚組織硒含量呈線性正相關(guān)。這與既往研究結(jié)論有所不同。在一項(xiàng)關(guān)于硒與過敏性哮喘的動物實(shí)驗(yàn)研究中，相較于低硒（日糧硒0.08 mg/kg）組和高硒（1.0 mg/kg）組，中硒（0.25 mg/kg）組小鼠的過敏性哮喘更加嚴(yán)重［1］。而一項(xiàng)隨機(jī)對照人體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沒有證據(jù)能證明補(bǔ)充硒有益于特應(yīng)性濕疹/皮炎的治療［6］。事實(shí)上，硒是一把雙刃劍，極度缺乏和過量都有可能有害［1］。當(dāng)膳食硒缺乏（≤ 0.1 mg/kg）時(shí)，主要硒蛋白酶活性和mRNA水平明顯受影響；但當(dāng)硒水平增加8倍（0.8 mg/kg）后，主要硒蛋白的酶活性和mRNA水平均進(jìn)入平臺區(qū)［7］。在另一項(xiàng)研究中，小鼠在飼料硒含量為0～0.2 mg/kg時(shí)，其生長發(fā)育未受影響；當(dāng)硒水平增加到2 mg/kg時(shí)，小鼠體重開始降低，并出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)錄改變；而當(dāng)硒含量達(dá)到5 mg/kg時(shí)，小鼠生長發(fā)育明顯受影響并產(chǎn)生肝毒性［8］。本實(shí)驗(yàn)中，過量硒組（3 mg/kg）小鼠皮炎表現(xiàn)更嚴(yán)重，而缺硒組最輕，提示硒可能通過影響免疫反應(yīng)水平導(dǎo)致過敏反應(yīng)的程度差異，進(jìn)而引起表現(xiàn)差異。

一般情況下，增加硒攝入量可以增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。然而，補(bǔ)充足夠的硒水平以期獲得額外的免疫保護(hù)的效果尚不確定［9］，特別是過敏性疾病。本研究中，攝入過量硒對小鼠AD不但沒有保護(hù)作用，反而加重皮膚免疫損傷，產(chǎn)生更為嚴(yán)重的皮炎表現(xiàn)；而硒攝入缺乏則可能因免疫抑制而減輕皮膚損傷，這可能與AD的免疫反應(yīng)特點(diǎn)有關(guān)。缺硒小鼠致敏時(shí)皮炎表現(xiàn)較正常硒組輕，可能因?yàn)槲狈σ种屏朔ㄊ夏液托叵俚纳L進(jìn)而抑制了免疫功能，機(jī)體對致敏原的反應(yīng)更低［10］。而過量硒組皮炎表現(xiàn)最為嚴(yán)重，可能與過量硒促進(jìn)異常免疫反應(yīng)，導(dǎo)致皮膚屏障缺陷從而引發(fā)更嚴(yán)重的皮炎有關(guān)［11］。

總之，微量營養(yǎng)素硒可能通過其生物學(xué)效應(yīng)影響機(jī)體免疫反應(yīng)水平，進(jìn)而影響皮炎的嚴(yán)重程度，其在過敏性疾病中的作用需要進(jìn)一步研究。