郝陽陽 張梁宇 王翔 童云峰 孫穎 陳楊

313000浙江湖州，解放軍第九八醫(yī)院皮膚科［郝陽陽（現(xiàn)在湖州市第一人民醫(yī)院皮膚科，313000）、張梁宇、童云峰、孫穎、陳楊］，藥械科（王翔）

細(xì)胞自噬是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的自我保護(hù)機(jī)制，通過形成自噬溶酶體來清除失去功能和變性受損的細(xì)胞器、大分子物質(zhì)以及入侵的微生物等，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和更新［1-2］。角質(zhì)形成細(xì)胞自噬水平降低導(dǎo)致細(xì)胞分化不全、炎癥水平升高，參與銀屑病的病理過程［3-4］。前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，喜樹堿可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞自噬，本研究中我們探討喜樹堿對人原代角質(zhì)形成細(xì)胞（human primary keratinocytes，HPK）自噬的影響。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑：喜樹堿（含量＞95%，日本東京化成工業(yè)公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶+乙二胺四乙酸（EDTA）消化液、Epilife培養(yǎng)基、人角質(zhì)形成細(xì)胞生長添加劑、慶大霉素/兩性霉素、TrypLE?Express酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品。中性蛋白酶Ⅱ（dispaseⅡ），膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-異硫氰酸熒光素（FITC）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)公司），兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）單克隆抗體（美國Novus公司），兔抗人p62單克隆抗體（美國Proteintech公司），兔抗人角蛋白6單克隆抗體（CK6，英國Abcam公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（美國Santa Cruz公司）。

2.標(biāo)本：標(biāo)本來源于2016年5-12月在解放軍第九八醫(yī)院泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)的健康成年及青少年男性，共12例，年齡10～23歲。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入選者均簽署知情同意書。

二、方法

1.完全培養(yǎng)基的配制：將5 ml人角質(zhì)形成細(xì)胞生長添加劑加入500 ml Epilif培養(yǎng)基中，混勻，分裝。

2.HPK的分離培養(yǎng)：獲取包皮組織后立即放入加有20 mg/L慶大霉素/兩性霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，PBS清洗3次，將組織放入含慶大霉素/兩性霉素的完全培養(yǎng)基中，去除皮下組織，將皮膚組織剪成5 mm ×5 mm小塊，加dispaseⅡ（1.2 U/ml）4℃避光過夜；次日分離表皮和真皮，棄真皮，用0.5%胰酶37℃消化表皮5～10 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，在孔徑100 μm的濾網(wǎng)上研磨表皮，過濾、離心，PBS洗滌2次，用含抗生素的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×106個(gè)/ml的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中；待細(xì)胞貼壁，可見細(xì)胞成簇生長，2～3 d換液1次，細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用TrypLE?Express酶消化細(xì)胞，傳代。在傳代過程中，逐漸降低培養(yǎng)基中抗生素的濃度。取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3.藥物處理：喜樹堿以DMSO溶解后，-20℃避光保存，存儲濃度為10 mol/L，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋成工作濃度。DMSO的終濃度≤0.1%。

4.CCK8檢測細(xì)胞增殖抑制率：將對數(shù)生長期HPK以1×104/孔接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入含不同濃度（200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L）喜樹堿的完全培養(yǎng)基100 μl，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，并設(shè)置正常對照組（不做任何處理），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48 h后，去除培養(yǎng)液，每孔加入含10 μl CCK8的培養(yǎng)液100 μl。同時(shí)設(shè)空白組，不加細(xì)胞，只加含10 μl CCK8的培養(yǎng)液100 μl。37 ℃、5%CO2條件下孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下吸光度（A值）。細(xì)胞增殖抑制率=［1-（實(shí)驗(yàn)組A450值-空白組A450值）/（正常對照組A450值-空白組A450值）］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

5.Annexin-FITC/碘化丙錠（PI）雙染法檢測細(xì)胞凋亡：細(xì)胞分組及處理同方法“二、4”，處理細(xì)胞24 h后檢測細(xì)胞凋亡。方法同文獻(xiàn)［5］。以Annexin V陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

6.免疫印跡法檢測LC3、p62蛋白的表達(dá)水平：細(xì)胞分組及處理同上，處理細(xì)胞24 h后進(jìn)行檢測，方法同文獻(xiàn)［5］。

7.間接免疫熒光法檢測LC3：細(xì)胞分為兩組，對照組（用含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基處理）和2 μmol/L喜樹堿組，處理24 h后檢測，方法同文獻(xiàn)［5］。在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核周圍觀察到3個(gè)或以上高密度的綠色熒光點(diǎn)即判定為自噬體陽性細(xì)胞。隨機(jī)在熒光顯微鏡下選取5個(gè)200倍視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中自噬體陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，取均值。

8.透射電鏡觀察細(xì)胞自噬超微結(jié)構(gòu)：將HPK以1×105/ml的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，每皿加10 ml完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，去除上清液，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含2 μmol/L喜樹堿的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用2.5%戊二醛4℃固定細(xì)胞過夜，PBS洗滌3次，加入1%鋨酸于4℃下振蕩固定3 h，PBS洗滌3次，乙醇逐級脫水，環(huán)氧丙烷置換，Suprr樹脂浸透包埋，最后在70℃烘箱中聚合。將不同材料的包埋塊在超薄切片機(jī)上切片，厚度70 nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察并拍照。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示。各均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊性。不同濃度喜樹堿組細(xì)胞增殖抑制率以及凋亡的總體差異采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，自噬體陽性細(xì)胞率采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同濃度喜樹堿對HPK增殖的影響

對照組和200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜樹堿組HPK增殖抑制率（表1）在24 h時(shí)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），2 μmol/L、6 μmol/L組抑制率顯著高于對照組（t=12.09、18.76，均P＜ 0.01），200 nmol/L組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.24，P＞0.05）。48 h時(shí)各組增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），各實(shí)驗(yàn)組抑制率均高于對照組（t=4.27、13.63、16.83，均P＜ 0.01）。

二、不同濃度喜樹堿對HPK凋亡的影響

對照組、200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜樹堿組24 h時(shí)凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組凋亡率均高于對照組（t=6.19、12.30、15.01，均P＜0.01）），隨著藥物濃度增加，促凋亡作用增強(qiáng)。見表1。

三、喜樹堿作用于HPK后LC3、p62蛋白的表達(dá)

不同濃度喜樹堿作用HPK 24 h后，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ在喜樹堿濃度為2、6 μmol/L時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；p62蛋白在2、6 μmol/L組輕度下調(diào)，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1、圖1。在喜樹堿濃度為2 μmol/L時(shí)，LC3-Ⅱ蛋白顯著上調(diào)，提示在此濃度時(shí)細(xì)胞自噬水平升高，因此選取該組細(xì)胞觀察自噬體及其超微結(jié)構(gòu)。

四、喜樹堿對HPK自噬體陽性細(xì)胞的影響

2 μmol/L喜樹堿作用HPK 24 h后，LC3間接免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核周及胞質(zhì)呈現(xiàn)高密度綠色熒光點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組綠色熒光強(qiáng)度較對照組明顯增強(qiáng)，對照組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也存在數(shù)量較多的熒光聚集點(diǎn)，見圖2。對照組和實(shí)驗(yàn)組自噬體陽性細(xì)胞百分率分別為（38.96±13.12）%、（60.16±8.78）%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.003，P＜ 0.05）。

表1 不同濃度喜樹堿對人原代角質(zhì)形成細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及LC3、p62蛋白表達(dá)的影響（±s）

表1 不同濃度喜樹堿對人原代角質(zhì)形成細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及LC3、p62蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。a與對照組比較，P＜0.01

組別24 h凋亡率（%）對照組200 nmol/L喜樹堿組2 μmol/L喜樹堿組6 μmol/L喜樹堿組F值P值增殖抑制率（%）24 h 1.60±0.78 7.59±1.82 33.90±3.65a 51.72±5.06a 152.9＜0.01 48 h 4.18±1.56 19.21±5.74a 52.09±3.01a 63.37±5.45a 123.8＜0.01 2.30±1.68 15.90±2.14a 29.33±3.51a 35.28±3.05a 89.57＜0.01自噬相關(guān)蛋白與β肌動蛋白灰度比值LC3-Ⅱ0.747±0.045 0.690±0.052 1.213±0.063a 1.292±0.057a 97.52＜0.01 p62蛋白1.203±0.133 1.287±0.117 0.905±0.103a 0.904±0.046a 9.47＜0.01

五、喜樹堿處理24 h后HPK內(nèi)自噬體超微結(jié)構(gòu)

2μmol/L喜樹堿組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見較多高電子密度的由雙層或單層膜包裹的囊泡樣結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)內(nèi)為胞質(zhì)成分，部分囊泡內(nèi)可見損傷的細(xì)胞器成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等；對照組胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞內(nèi)容物均一，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，囊泡樣結(jié)構(gòu)相對較少。見圖3。

討 論

圖1 不同濃度喜樹堿作用人原代角質(zhì)形成細(xì)胞24 h后LC3、p62蛋白表達(dá)

圖2 LC3間接免疫熒光觀察人原代角質(zhì)形成細(xì)胞自噬體的形成

圖3 人原代角質(zhì)形成細(xì)胞自噬體超微結(jié)構(gòu)

因HPK培養(yǎng)周期長、細(xì)胞穩(wěn)定性難以保證、培養(yǎng)基昂貴，既往對于角質(zhì)形成細(xì)胞的研究多采用人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT。HaCaT細(xì)胞與HPK在細(xì)胞形態(tài)、生長周期以及對外界刺激反應(yīng)方面均存在較大差異。實(shí)驗(yàn)中HaCaT細(xì)胞增殖明顯較HPK快，在抵御外界刺激如紫外線時(shí)，易受外界刺激損傷，而HPK更耐受中波紫外線照射引起的損傷，在細(xì)胞自噬水平上兩者也不同，HPK的基礎(chǔ)自噬水平遠(yuǎn)高于HaCaT細(xì)胞［6］。上述差異說明，HaCaT細(xì)胞不能較好地代表人角質(zhì)形成細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。因此，使用HPK能充分模擬人生理?xiàng)l件下的角質(zhì)形成細(xì)胞，在細(xì)胞生物學(xué)研究中HPK的參考價(jià)值更高。

我們前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，5、10 nmol/L喜樹堿可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生自噬，對細(xì)胞增殖、凋亡無顯著影響，50、100、200 nmol/L喜樹堿抑制 HaCaT細(xì)胞增殖，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，自噬水平降低。本研究中2、6 μmol/L喜樹堿可明顯抑制HPK增殖，200 nmol/L喜樹堿作用24 h對細(xì)胞增殖無顯著影響，但作用48h對細(xì)胞增殖產(chǎn)生部分抑制。200nmol/L、2μmol/L、6 μmol/L喜樹堿作用細(xì)胞24 h，均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞自噬方面，2 μmol/L、6 μmol/L喜樹堿作用24 h可誘導(dǎo)HPK產(chǎn)生自噬，自噬相關(guān)LC3蛋白表達(dá)量明顯增加，p62蛋白水平輕度下降，間接免疫熒光、透射電鏡均證明喜樹堿可誘導(dǎo)HPK自噬水平升高。p62蛋白是一種支架蛋白，在自噬小體形成過程中其作為連接LC3和聚泛素化蛋白之間的橋梁，通過泛素信號途徑將變性蛋白、受損的細(xì)胞器以及入侵細(xì)胞的微生物轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬小體進(jìn)行降解［6］。自噬抑制可導(dǎo)致p62聚集，自噬水平升高時(shí)p62降解增加，因此p62蛋白的多少可以作為自噬流的測定指標(biāo)［7］。本研究還表明，HPK基礎(chǔ)自噬水平較高，與以往研究一致［8］。喜樹堿抑制HPK增殖、誘導(dǎo)凋亡及自噬的藥物濃度均較HaCaT細(xì)胞（自噬誘導(dǎo)濃度5 ～ 10 nmol/L，凋亡誘導(dǎo)濃度 50 nmol/L）［5］明顯增加，提示HPK對喜樹堿有較好的耐受性，而HaCaT細(xì)胞易受到藥物損傷，兩者對藥物反應(yīng)性不同。這種差異性與細(xì)胞本身性質(zhì)不同有關(guān)。

細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下存在一定水平的自噬，以維持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的更新，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡［9］。自噬在維持角質(zhì)形成細(xì)胞正常功能中起重要作用，自噬水平下降可導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖、分化和炎癥［3-4，10］，而銀屑病的發(fā)病與角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖、分化及炎癥密切相關(guān)。Akinduro等［11］研究發(fā)現(xiàn)，自噬在皮膚顆粒層的形成中起關(guān)鍵作用，胎鼠皮膚在顆粒層形成之前，基底層和棘層細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、自噬相關(guān)蛋白1（ATG1）、beclin1、自噬相關(guān)蛋白（ATG）5-ATG12復(fù)合物表達(dá)水平低，而顆粒層的形成伴自噬相關(guān)蛋白的顯著升高。細(xì)胞自噬在角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化中起重要的作用，在角質(zhì)層細(xì)胞核逐漸消失的過程中，核自噬（nucleophagy）是其主要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白7（ATG7）缺陷可使角質(zhì)形成細(xì)胞抵抗內(nèi)外氧化應(yīng)激功能嚴(yán)重受損，并且導(dǎo)致了DNA損傷［12］。

在角質(zhì)形成細(xì)胞的老化過程中，衰老的細(xì)胞并非死于凋亡，而是死于高水平的自噬活動［13-14］。喜樹堿可通過抑制端粒酶的活性誘導(dǎo)正常細(xì)胞啟動凋亡程序，還可通過腫瘤壞死因子α和Fas/Fas L途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞直接凋亡［15］。在HPK中，喜樹堿誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的同時(shí)，細(xì)胞凋亡增加，可能出現(xiàn)了自噬性程序性死亡，也可能同時(shí)出現(xiàn)了自噬和凋亡。但自噬和凋亡在原代角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞中的相互關(guān)系并不相同。

總之，喜樹堿可誘導(dǎo)HPK產(chǎn)生自噬，提高角質(zhì)形成細(xì)胞的自噬水平。然而，喜樹堿誘導(dǎo)原代角質(zhì)形成細(xì)胞自噬的機(jī)制以及自噬與凋亡的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。