楊銘，胡曉星，王文廣，張莉，董書維，馮悅，代解杰*，夏雪山*

(1. 昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，昆明 650500；2. 中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩標準化研究與疾病動物模型創(chuàng)建省創(chuàng)新團隊，昆明 650118)

研究報告

EV71病毒對樹鼩原代腎上皮細胞感染模型的建立

楊銘1，胡曉星1，王文廣2，張莉1，董書維1，馮悅1，代解杰2*，夏雪山1*

(1. 昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，昆明 650500；2. 中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩標準化研究與疾病動物模型創(chuàng)建省創(chuàng)新團隊，昆明 650118)

目的 建立EV71對樹鼩原代腎細胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法獲得樹鼩的原代腎細胞，用EV71感染樹鼩腎細胞，測定1、2、4、6和8 d培養(yǎng)上清病毒滴度，分別用Western blot和間接免疫熒光法檢測細胞中EV71病毒VP1蛋白的表達，以確定EV71病毒對樹鼩原代腎細胞的感染性。結(jié)果 對分離得到的樹鼩原代腎細胞進行傳代純化和形態(tài)鑒別，建立以樹鼩原代腎細胞為主的細胞培養(yǎng)。用EV71病毒感染樹鼩原代腎細胞，感染后48 ～ 96 h病毒滴度可達到1.3×106TCID50/mL，說明EV71病毒可有效感染樹鼩原代腎細胞并有效增殖。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ～ 8 d的樹鼩原代腎細胞中有效檢出，間接免疫熒光法則在感染后2 ～ 6 d細胞的細胞質(zhì)中檢測到病毒VP1蛋白的分布。結(jié)論 在成功建立樹鼩原代腎細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，確定了EV71病毒對樹鼩原代腎細胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71樹鼩原代腎細胞感染模型。

樹鼩原代腎細胞；EV71；病毒增殖；VP1蛋白；感染模型

人腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是導致人手足口病的主要病原體之一，主要感染人群為5歲以下的嬰、幼兒，重癥感染可引發(fā)嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心肺系統(tǒng)并發(fā)疾病，嚴重威脅人類健康[1]。目前，盡管已有可預防EV71感染的疫苗上市，仍需要建立合適的手足口病動物模型，用于病毒感染后致病機制研究和藥物研發(fā)。現(xiàn)有的EV71感染動物模型主要為幼齡小鼠或乳鼠、免疫缺陷小鼠，以及非人靈長類的食蟹猴、恒河猴[2, 8]。

樹鼩(Tupaiabelangeri, tree shrew)是一種屬于攀鼩目的小型哺乳動物，主要分布于南亞，東南亞以及中國的西南地區(qū)。作為一種與靈長類親緣關(guān)系較近的新型實驗動物[3-5]，其體型較小、繁殖周期短、成本較低以及在生理解剖方面和靈長類高度相似等特點，現(xiàn)已被用于建立了多種人類病毒性疾病的動物模型[6]，如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎(HCV)和單純皰疹病毒(HSV)等[7]。2012年，王文廣等[8]發(fā)現(xiàn)EV71能夠感染幼齡中緬樹鼩，在手掌、口鼻除出現(xiàn)水泡等典型的手足口病癥狀，初步證實樹鼩可以作為EV71手足口病的疾病動物模型。

在建立病毒感染動物活體模型的同時，建立合適的動物感染細胞模型，對于EV71感染與致病機制的深入研究，以及體外藥物篩選與評價都至關(guān)重要。目前，與EV71相關(guān)的體外感染及其機制的深入研究都以細胞系作為主要工具，在與活體機能更為相似的原代細胞上開展的研究較少報道。本研究在EV71可以感染樹鼩活體，認為樹鼩可以作為EV71病毒感染模型的基礎(chǔ)上，分離培養(yǎng)樹鼩的原代腎細胞，確定EV71病毒對其感染與增殖特性，探索建立EV71感染樹鼩原代腎細胞模型，并為建立EV71感染樹鼩手足口病模型提供必要的佐證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與EV71病毒株

經(jīng)人工繁育的清潔級，4月齡F1代雄性中緬樹鼩1只，體重145 g，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心【SCXK(滇)2013-0001】繁育。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料，飼養(yǎng)和實驗操作在昆明理工大學實驗動物中心。EV71標準株(2010FJLY008)，來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，以Vero細胞進行培養(yǎng)，測定其滴度為1.1×105TCID50/mL。

1.2 樹鼩原代腎上皮細胞的培養(yǎng)與鑒定

樹鼩腹腔注射苯巴比妥進行麻醉，解剖取出雙側(cè)腎臟，用含青鏈霉素的D-Hank’s清洗3次，去除腎蒂及包膜，用眼科剪將其剪成1 mm3左右的顆粒狀，轉(zhuǎn)移至含0.25 %的胰蛋白酶消化液中，37℃孵育1 h，每隔10 min振蕩30 s。消化1 h后用100目的網(wǎng)篩過濾，去除組織塊后加入完全培養(yǎng)基(10% FBS + 90% RPMI 1640)中和胰酶，1000 r/min離心15 min離心洗滌3次，獲得樹鼩原代腎細胞。用含有5 ng/mL表皮生長因子(EGF，購自Pepro Tech)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基(10% FBS + 90% RPMI 1640)，5% CO2、37℃培養(yǎng)細胞，每2 d換一次培養(yǎng)基，并根據(jù)細胞生長狀況進行胰酶消化傳代。

根據(jù)原代腎細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的敏感度差異以及細胞貼壁的時間不同，對分離得到的原代腎細胞進行純化，經(jīng)2次傳代培養(yǎng)即可獲得較純的腎細胞。用角蛋白18(CK18)抗體(Abcam公司)和熒光二抗(goat anti-mouse FITC)對樹鼩腎細胞進行免疫熒光檢測，確定腎上細胞的比例與純度。

1.3 EV71病毒感染樹鼩原代腎細胞與病毒增殖情況測定

按感染復數(shù)為0.1(MOI=0.1)的EV71病毒感染Vero細胞，維持培養(yǎng)至36 h時收取培養(yǎng)上清，為用于感染樹鼩原代腎細胞的EV71病毒液。以感染復數(shù)為2(MOI=2)的EV71病毒接種原代樹鼩腎細胞，同時設Vero細胞作為陽性對照，在培養(yǎng)箱中孵育2 h后去除上清，使用PBS洗6次，以最后一次洗液作為0 d對照。

用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)感染病毒的細胞，每12 h收集一次病毒上清，提取上清中的核酸，一步法RT-PCR檢測病毒核酸(TaKaRa One-Step RT-PCR Kit)，上游引物VP1-F2：GCCTATATAATAGCACTAGCGGCAG，下游引物VP1-R2：TTGACC ACTCTAAAGTTACCCACAT，擴增片段為507 bp)。TaqMan熒光定量PCR法檢測上清中的病毒載量(TaKaRa One-Step PrimeScript RT-PCR Kit)，上游引物：EvF1(474-493 bp)-TGGAGCCCCTAAGCCAGATT，下游引物EvR1(577 - 596 bp)-CTCGCAGGTGACATGAATGG，探針序列為：TaqMan Probe(504 - 528 bp)：CCTTGCATGGCAAACCGCCACTAAC。

1.4 EV71病毒滴度檢測

注：紅圈部分表示纖維細胞。圖1 樹鼩原代腎上皮細胞的培養(yǎng)、純化及鑒定(10×10)Note.The red circles represent the fibrocytes.Fig.1 Culture, purification and identification of the primary renal epithelial cells from tree shrew

將Vero細胞以5×103的密度接種到96孔板中，取收獲的病毒上清50 μL，用無血清的DMEM培養(yǎng)基進行10倍梯度稀釋，每個梯度設4個復孔。將稀釋好的病毒接種到長成致密單層的Vero細胞中，每孔100 μL，正常細胞對照組中僅加入細胞培養(yǎng)液，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄去孵育液，加入含2.5 % FBS的DMEM培養(yǎng)基維持液，置于37℃ 5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)，直至CPE不再增加時(6～7 d)，按照Reed- Muench法計算病毒滴度(TCID50/mL)。

1.5 樹鼩原代腎細胞中EV71 VP1的表達檢測

Western blot 檢測EV71 VP1蛋白。感染后1、2、4、6 d和8 d收集的樹鼩原代腎細胞，及病毒感染與不感染Vero細胞，用RIPA裂解液(購自北京碧云天生物技術(shù))提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量后，按上樣量為20 μg進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用anti-mouse VP1一抗和HRP二抗(Abcam)進行細胞中EV71 VP1蛋白檢測。

間接免疫熒光檢測EV71 VP1蛋白在樹鼩腎細胞中的表達。甲醇固定細胞病毒感染后1、2、4 d和6 d的樹鼩原代腎上皮細胞，經(jīng)anti-mouse VP1 一抗和 goat anti-mouse FITC二抗(Abcam)標記，熒光顯微鏡下檢測被感染細胞中VP1蛋白的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩原代腎細胞的分離培養(yǎng)及鑒定

用優(yōu)化的培養(yǎng)條件對分離得到的樹鼩原代腎細胞進行培養(yǎng)至第4 天，可顯微觀察到細胞形態(tài)呈現(xiàn)出不規(guī)則多邊形，細胞間界限和輪廓較為清晰(圖1-a)，細胞生長與增殖狀況良好。傳代純化傳至第2代時，培養(yǎng)細胞中存在較少的成纖維細胞(圖b中紅色圈所示)已幾乎不見(圖c)，角蛋白CK18抗體進行免疫熒光鑒定發(fā)現(xiàn)，大多細胞呈現(xiàn)出特異性綠色熒光，樹鼩原代腎細胞的純度達90 % 以上(圖1d)。

注：(a)M. DL2000 Marker； 1. Vero細胞感染后培養(yǎng)上清； 2. Vero細胞洗液； 3. 樹鼩原代腎細胞感染后培養(yǎng)上清； 4. 樹鼩原代腎細胞洗液； 5. 未感染樹鼩腎細胞培養(yǎng)上清。(b)0 h為洗液；ns為差異無顯著性；**表示P<0.01，***表示P<0.001，差異有顯著性。圖3 EV71感染樹鼩原代腎細胞和Vero細胞上清中病毒核酸檢測Note. (a): M. DL2000 marker; 1, the culture supernatant of Vero cells after infection; 2, supernatant of the Vero cell after infection; 3, the culture supernatant of tree shrew primary renal cells after infection; 4, wash solution of the tree shrew primary renal cells; 5, cell culture supernatant of the tree shrew primary renal cells was not infected. (b): 0h is wash solution; ns represents non-significant differences; **P<0.01 and ***P<0.001 indicate significant differences. Fig.3 Detection of the EV71-infected primary renal cells of tree shrew and Vero cells

2.2 樹鼩原代腎細胞培養(yǎng)與細胞增殖

對樹鼩原代腎細胞維持培養(yǎng)至17 d，通過MTT法測定其細胞活力，繪制樹鼩原代腎細胞增殖曲線(圖2)，同時設Vero細胞作為對照進行比較。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，樹鼩原代腎細胞可有效增殖，線性增殖可至第10天達到細胞增殖平臺期。培養(yǎng)前期樹鼩原代腎細胞的增殖能力基本等同于Vero細胞系，培養(yǎng)至11～17 d的過程中，樹鼩原代腎細胞增殖能力相比Vero細胞逐漸下降，至15 d開始明顯下降，表明15 d以后樹鼩原代腎細胞開始凋亡。

圖2 樹鼩原代腎細胞和Vero細胞培養(yǎng)增殖特性Fig.2 Proliferation of primary renal cells of tree shrew and Vero cells

2.3 EV71感染樹鼩原代腎細胞與病毒增殖

Vero細胞接種EV71病毒后，培養(yǎng)36 h收取細胞上清，經(jīng)測定上清中病毒滴度為1.1×108TCID50/mL。用培養(yǎng)得到的EV71病毒感染樹鼩原代腎細胞和Vero細胞，最后一道洗液及感染48 h的培養(yǎng)上清，提取病毒核酸進行RT-PCR檢測。如圖3-a所示，Vero細胞和樹鼩原代腎細胞的培養(yǎng)上清中都能檢測到EV71的特異性目的條帶，大小為507 bp，而洗液及陰性對照均未擴增出目的條帶。

用實驗室建立的熒光定量PCR(TaqMan探針法)法檢測培養(yǎng)上清中的EV71病毒載量，感染樹鼩原代腎細胞培養(yǎng)上清中病毒載量為106copies/μL，遠高于洗液中殘留的病毒量，但明顯低于陽性Vero細胞產(chǎn)生的病毒量(圖3-b)。據(jù)此結(jié)果，可初步確定EV71可以感染樹鼩原代腎細胞并有效增殖。

以最適感染復數(shù)的EV71病毒接種樹鼩原代腎細胞，每隔12 h收取培養(yǎng)上清測定病毒載量和滴度，繪制EV71在樹鼩原代腎上皮細胞中的增殖曲線(圖4)。根據(jù)病毒在樹鼩原代腎細胞增殖曲線知，病毒感染樹鼩原代腎上皮細胞48 h內(nèi)，上清中病毒載量與病毒滴度呈線性升高的趨勢，48 ～ 96 h上清中病毒隨著培養(yǎng)時間的延長緩慢上升，在96 h達到高峰，然后病毒載量仍可維持較高水平，但病毒滴度顯著下降。通過觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，病毒感染96 h時細胞已經(jīng)開始凋亡，至192 h(8 d)時細胞幾乎完全脫落。EV71感染樹鼩原代腎細胞后的48 ～ 96 h期間病毒滴度最大，達到1.3×106TCID50/mL，進一步說明EV71病毒能夠感染樹鼩原代腎細胞并有效增殖。

圖4 EV71在樹鼩原代腎細胞中的增殖曲線Fig.4 Proliferation curves of EV71 virus in the primary renal cells of tree shrew

2.4 EV71感染樹鼩原代腎細胞中VP1蛋白表達

EV71感染樹鼩原代腎細胞后不同時間收集感染上清與細胞，Western blot法檢測被感染細胞內(nèi)的病毒蛋白VP1。如圖5所示，在感染后的第1天，未能檢測到VP1蛋白，而在感染后2 ～ 8 d內(nèi)均能夠檢測到特異性VP1蛋白條帶。陽性對照Vero細胞在被感染后第2天的VP1蛋白最明顯，然后4 ～ 8 d時處于同一水平，較第2天弱一些。未感染的樹鼩原代腎上皮細胞(negative)未檢測到VP1蛋白。

免疫熒光法檢測EV71感染樹鼩原代腎細胞后VP1蛋白在細胞內(nèi)表達情況。觀察發(fā)現(xiàn)，在感染后的第1天，并未檢測到明顯的用于標記VP1蛋白的綠色熒光反應，而只能見到DAPI復染細胞核的藍色熒光，說明病毒還未發(fā)生明顯的復制活動。從感染后第2 天開始至第6 天均能檢測到明顯的綠色熒光，主要圍繞在細胞核的外周質(zhì)中，說明EV71的VP1蛋白主要表達于被感染細胞的細胞質(zhì)中，這一現(xiàn)象和EV71 感染Vero細胞(4 d)后的現(xiàn)象相同，標記VP1蛋白的綠色熒光分布于細胞核周圍的胞質(zhì)中。未感染的樹鼩原代腎上皮細胞未檢測到綠色熒光，只能見到DAPI復染的細胞核。

WB檢測與免疫熒光觀察結(jié)果均表明，EV71病毒能夠感染樹鼩原代腎細胞，并且在細胞內(nèi)有效增殖，VP1蛋白主要存在于細胞質(zhì)中。

圖5 Western blot檢測EV71 VP1蛋白在樹鼩原代腎上皮細胞中的表達Fig.5 Expression of EV71 VP1 protein in the tree shrew primary renal cells detected by Western blot

圖6 免疫熒光檢測EV71 VP1在樹鼩原代腎上皮細胞中的表達(10×10)Fig.6 Immunofluorescence detection of EV71 VP1 protein in the tree shrew primary renal cells

3 討論

當前EV71感染的動物模型研究主要是以幼齡、免疫缺陷或基因修飾小鼠以及恒河猴作為對象，但小鼠在遺傳和親緣關(guān)系上與人相對較遠，而非人靈長類的恒河猴成本較高。樹鼩作為一種低等靈長類動物，因其與人類的親緣關(guān)系較近、成本低、繁育周期短等優(yōu)點，現(xiàn)已被運用于人類相關(guān)重大疾病的研究[7,9,10]。在王文廣等[8]關(guān)于幼齡樹鼩能夠感染EV71的實驗基礎(chǔ)上，本實驗采用樹鼩的原代腎上皮細胞進行EV71體外感染特性的研究。對于原代腎上皮細胞的分離培養(yǎng)已有文獻報道，而本實驗采用的是張麗嬌等[11]報道的胰酶消化法來獲取樹鼩的原代腎上皮細胞，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件得到了較純的樹鼩原代腎上皮細胞，并通過角蛋白CK18鑒定[12，13]。通過比較Vero細胞系和樹鼩原代腎上皮細胞的生長特性，發(fā)現(xiàn)樹鼩原代腎上皮細胞和Vero細胞在15 d以內(nèi)可由對數(shù)生長期至平臺期，并能在對數(shù)期維持一定的生長活力，由此說明樹鼩原代腎上皮細胞能夠充分滿足體外EV71感染實驗的條件。

通過EV71對樹鼩原代腎上皮細胞和Vero細胞感染48 h后的核酸以及培養(yǎng)上清病毒載量的測定，結(jié)果是在感染樹鼩原代腎上皮細胞的培養(yǎng)上清中能明顯檢測到了病毒的擴增條帶，這和陽性對照的Vero細胞結(jié)果一致。并且再測定兩種細胞培養(yǎng)上清中的病毒載量時發(fā)現(xiàn)沒有存在顯著性的差異，且都要明顯地高于0 h的洗液，初步確立了EV71能夠較好地感染樹鼩原代腎上皮細胞，并且病毒能夠在細胞內(nèi)進行復制過程。為了進一步確定EV71在被感染細胞內(nèi)的感染和復制活動，本研究通過Western blot和免疫熒光分別檢測了細胞內(nèi)的EV71病毒蛋白VP1和定位情況。比較樹鼩原代腎上皮細胞和Vero細胞的結(jié)果，其能夠證明和Vero細胞一樣，在經(jīng)EV71感染2 d后開始，此后在不同時間段均能檢測到VP1蛋白的持續(xù)存在，這和免疫熒光的檢測結(jié)果相吻合，說明EV71在感染樹鼩原代腎上皮細胞后的6 ～ 8 d內(nèi)，病毒可持續(xù)存在并活動。

通過本研究，我們成功分離并優(yōu)化了樹鼩原代腎上皮細胞的培養(yǎng)條件，得到較純且生長狀態(tài)良好的原代腎上皮細胞，進而成功建立了EV71的樹鼩體外細胞感染模型。在進行樹鼩的原代腎上皮細胞感染后，通過系統(tǒng)地評價其感染特性，根據(jù)被感染細胞中病毒的核酸和蛋白層面檢測結(jié)果，均能夠證明EV71可以感染樹鼩體外的原代腎上皮細胞，其特征和Vero細胞相符。以上這些研究成果能夠為后繼進一步深入的研究EV71的體外感染機制奠定基礎(chǔ)。同時，EV71對樹鼩體外感染模型的建立為將來細胞層面的藥物篩選提供了平臺，進而也為樹鼩活體感染模型的研究提供必要的依據(jù)。

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Establishment of a EV71 virus infection model of tree shrew primary renal cells

YANG Ming1，HU Xiao-xing1，WANG Wen-guang2，ZHANG Li1， DONG Shu-wei1， FENG Yue1，DAI Jie-jie2*，XIA Xue-shan1*

(1. Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China;2. Yunnan Provincial Innovation Group of Tree Shrew Standard Culture and Animal Model, Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Kunming 650118)

Objective To establish an enterovirus 71 (EV71) infection model of tree shrew primary renal cells. Methods Tree shrew primary renal cells were obtained by trypsin digestion. After subculture and purification, EV71 virus was used to infect these primary cells. The culture supernatant of these EV71-infected cells was collected for virus titer detection at 1, 2, 4, 6 and 8 days post-infection. The cells were collected for detection of EV71 VP1 protein by Western blot assay. Furthermore, the expression and location of VP1 protein in the infected cells were detected by indirect immunofluorescence assay. Vero cells were taken as positive control to evaluate the infectivity of EV71 virus to tree shrew primary renal cells. Results Morphologically, the cultured cells were proved to be majorly consisted of the primary renal cells after subculture and purification. The obtained primary cells were infected by EV71 virus. The virus titer was up to 1.3 × 106TCID50/mL during 48-96 h post-infection, proving that EV71 virus infected and proliferated in the tree shrew primary renal cells. Western blot showed that the viral VP1 protein was detected from infected primary cells at 2 to 8 d post infection. VP1 protein was also observed in the cytoplasm at 2 to 6 d post infection by indirect immunofluorescence. Compared with Vero cells, the infectivity of EV71 virus to tree shrew primary renal cells and its proliferation were confirmed. Conclusions Based on the successful establishment of cell culture of tree shrew primary renal cells, the infectivity to the obtained cells and proliferation of EV71 virus in the cells are confirmed. The model of EV71 virus-infected tree shrew primary renal cells is initially established.

Tree shrew, primary renal cells；EV71 virus；Virus proliferation；Protein VP1；Infection model

XIA Xue-shan, E-mail: oliverxia2000@aliyun.com; DAI Jie-jie, E-mail： djj@imbcams.com.cn

國家科技支撐計劃項目子課題 (2014BAI01B01)。

楊銘 (1991-)，男，碩士生，研究方向：病毒樹鼩模型。E-mail： qjyangming@163.com

夏雪山，教授，研究方向：分子病毒學。E-mail： oliverxia2000@aliyun.com； 代解杰，研究員，主要研究方向：樹鼩動物模型。E-mail： djj@imbcams.com.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0117-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.002

2016-12-08