罕園園，孫曉梅，匡德宣，陸彩霞，陳玲霞，仝品芬，王文廣，李娜，代解杰

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團隊，昆明 650118)

研究報告

樹鼩中APP基因特征描述及可變剪接體的分型鑒定

罕園園，孫曉梅，匡德宣，陸彩霞，陳玲霞，仝品芬，王文廣，李娜，代解杰*

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團隊，昆明 650118)

目的 區(qū)分并鑒定樹鼩中APP基因mRNA的多種可變剪接體，對APP基因特征進行描述，并確定其在各組織中的表達分布。方法 參考已知人的和樹鼩基因組預(yù)測的APP基因序列，設(shè)計樹鼩APP基因mRNA剪切體外顯子的共同特異性引物。分別從樹鼩不同組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用高保真酶擴增目的剪切體DNA。根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶的有無和大小初步判斷剪接體的型別，最后將PCR產(chǎn)物膠回收進行測序鑒定，對獲得的基因進行特征描述，并結(jié)合定量PCR的結(jié)果確定了各剪接體在不同組織中分布情況。結(jié)果 結(jié)果表明樹鼩APP剪接體的全長為3514 bp，有一個109 bp的5’-UTR，1092bp的3’-UTP。APP基因在調(diào)查的9個物種中高度同源保守，顯示樹鼩與靈長類存在一個較近的親緣關(guān)系。通過三維建模獲得了樹鼩和人的APP基因共同擁有的4個結(jié)構(gòu)域。同時確認這4種通過外顯子跳躍產(chǎn)生的APP可變剪接體在不同組織中的分布和表達。4種檢測到的剪接體APP770，APP695，APP751，APP677均表達于肺、腎和腸，表達量最高的是肺、肌肉和睪丸。結(jié)論 對樹鼩APP基因可變剪接體的表達研究，有助于推動樹鼩作為阿爾茨海默病模型深入研究疾病的發(fā)生機制和藥物研發(fā)。

樹鼩；APP基因；可變剪接體；阿爾茨海默病模型

淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達的跨膜蛋白。它是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)病理改變老年斑的主要成分β淀粉蛋白(amyloid beta protein, Aβ)的前體蛋白。Aβ聚集形成的寡聚體具有神經(jīng)毒性，被認為是AD的主要病理機制，這些過量產(chǎn)生的Aβ主要來源于APP的異常裂解，因此，APP一直被認為是是阿爾茲海默病AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]。在人體內(nèi)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10種APP 基因的轉(zhuǎn)錄物，它們主要由三個不同的外顯子(外顯子2、7、8、15)經(jīng)可變剪接所產(chǎn)生。APP 的表達非常廣泛，可存在于幾乎所有的神經(jīng)元和非神經(jīng)元組織。但是，各種轉(zhuǎn)錄物的表達方式顯示一定的細胞和組織特異性。如含有Kunitz型蛋白酶抑制劑(Kunitz protease inhibitor, KPI)序列的APP751 和APP770 主要表達于非神經(jīng)元組織，而不含KPI 序列的APP695則主要表達于神經(jīng)元。另外，在腦發(fā)育、成熟過程及部分AD 病人，剪接形式也可發(fā)生變化[2]。

APP基因的序列、結(jié)構(gòu)對Aβ的聚集有重要的作用，基于人基因組中發(fā)現(xiàn)的家族性APP基因突變而建立的轉(zhuǎn)基因小鼠由于能夠過表達APP基因，從而造成Aβ的聚集沉淀，形成類似人AD中最主要的病理特征—老年斑(senile plaques, SP)，是現(xiàn)在研究AD的重要動物模型。Aβ形成年齡依賴性的SP并在腦相關(guān)區(qū)域聚集沉淀，這種現(xiàn)象在許多的哺乳動物中都有發(fā)現(xiàn)，包括熊、牛、狗、貓和所有的非人靈長類[3, 4]。在這些動物中Aβ的序列與人類完全一致，但目前為止，尚未在大、小鼠中發(fā)現(xiàn)類似的SP存在，這很可能是因為大、小鼠Aβ在序列與人有3個氨基酸序列的差異導致Aβ無法聚集形成SP。

樹鼩屬于介于靈長目與食蟲目之間的獨立階元—攀鼩目樹鼩科，與嚙齒類相比，樹鼩更接近非人靈長類和人類。現(xiàn)在世界上許多國家已經(jīng)開展了樹鼩實驗動物方面的研究，并取得了豐碩的成果[5]。樹鼩是公認的近視模型動物[6]，又因其大腦發(fā)達，多用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究及神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的復制，如腦血管病[7]、抑郁癥[8]、老年癡呆[9]等，2012年，Yamashita 等[10]的報道支持了獼猴和樹鼩均有這種人類老年癡呆癥病理樣的老年斑。從基因序列上來說，Pawlik等[4]早在1999年便對腦中的APP基因序列進行了測定，獲得了APP一個可變剪接體的序列信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和人的同源性大于大小鼠，并且Aβ序列也和人類的完全一致。綜上，樹鼩有可能是創(chuàng)建人類老年癡呆癥模型的理想動物。

通過鳥槍測序法獲得的樹鼩基因組序列中，對樹鼩的APP基因及可變剪接體進行了預(yù)測，依據(jù)測序結(jié)果與人相應(yīng)序列的比對，預(yù)測得到樹鼩可能存在6種剪接體[11]，不排除這些潛在的剪接體有些可能實際上并不存在以及有其他剪接體存在的可能。鑒于APP基因在AD中的重要作用及樹鼩在阿爾茲海默癥模型的應(yīng)用，弄清樹鼩APP基因的所有剪接體的類型及在不同組織的表達差異、表達模式，對今后阿爾茲海默癥樹鼩動物模型創(chuàng)制和疾病發(fā)生機理研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及分析軟件

滇西亞種雄性樹鼩(Tupaiabelangeri)，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心【SCXK(滇)K2013-0001】提供。TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Primer-Star DNA聚合酶、DNA Marker DL 2000購自TaKaRa Biotechnology公司(大連，中國)；膠回收試劑盒購自Tiangen公司(北京，中國)。利用生物信息學軟件DNAman進行比對分析，利用生物信息學軟件Mega7繪制系統(tǒng)進化樹。利用Swiss Model工作站進行三維建模，并用Pymol顯示。

1.2 分子生物學方法

1.2.1 引物設(shè)計

通過在PubMed上查詢已知人的(基因ID：351)和預(yù)測的樹鼩APP基因序列(基因ID：102489280，KF479228.2)，根據(jù)此設(shè)計出共同的特異性引物。利用電泳區(qū)分出不同長度的剪接體，膠回收后測序確定其分型。

1.2.2 總RNA的提取

樹鼩組織RNA的提取和定量。精確稱量100 mg樹鼩各組織，加入1 mL預(yù)冷的TRIzol提取液，使用超聲粉碎的方法將組織充分裂解，其余步驟按TRIzol試劑說明書進行。所提取的RNA 溶解于DEPC處理水中。采用紫外分光光度法定量。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄

為cDNA利用RT-PCR方法擴增APP cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒中的說明書進行。

1.2.4 PCR擴增

以O(shè)ligo(dT)為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，之后以此為模板，進行PCR擴增。在反應(yīng)體系中先將模板于95℃變性5 min，循環(huán)參數(shù)：94℃30 s，55℃45 s，72℃ 1 min，35 個循環(huán)，72℃延伸10 min。APP上游：GTGCCCACTGACGGCAAT，APP下游：GCTCCTCCAGGGATGTATTTATT。

1.2.5 PCR的產(chǎn)物回收

擴增產(chǎn)物的膠回收用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢查PCR 產(chǎn)物。之后將PCR 條帶用手術(shù)刀小心割取，按照膠回收試劑盒說明書分步回收PCR 產(chǎn)物。

1.2.6 PCR測序

產(chǎn)物測序?qū)㈦娪竞蠡厥盏腜CR產(chǎn)物送上海生工公司測序，檢測PCR產(chǎn)物的正確性。

1.2.7 總APP剪接體定量PCR

反應(yīng)混合液為2× qPCR預(yù)混液10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，模板2 μL。引物見表1。PCR循環(huán)條件為保持3 min 95℃(95℃、7 s， 57℃、10 s，72℃、15 s)45個循環(huán)。APP定量上游：GAAGCCAACCAACCAGTGAC，APP定量下游：CTAAGCAGCGGTAGGGAATG，GDPH定量上游：CCATCACCATCTTCCAGGAGCGAG，GDPH定量下游：CAAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG。

2 結(jié)果

2.1 APP770核酸序列和推導的氨基酸序列

樹鼩的APP基因由18個外顯子構(gòu)成。測序結(jié)果表明樹鼩APP剪接體的全長為3514 bp，有一個109 bp的5’-UTR，1092 bp的3’-UTP。三個潛在的AATAAA聚腺苷酸化信號位于多聚Aβ尾巴上游處。在推測的樹鼩APP基因氨基酸產(chǎn)物中，在N端攜帶有一個19氨基酸殘基的信號肽(圖1)。

圖1 樹鼩APP基因的核酸序列和推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of APP gene in the Tupaia chinensis

2.2 APP基因的進化分析

為評價APP蛋白的進化保守性，與其他物種(人、食蟹猴、大鼠、小鼠、豬、狗、黑猩猩、兔)的氨基酸序列的比對分析。顯示，APP基因在調(diào)查的9個物種中高度同源保守，有一個17個氨基酸的信號肽序列，同源性很高。樹鼩與人的APP氨基酸序列有97.3%的一致性，僅有20個氨基酸序列不同，并且大部分差異氨基酸位于蛋白末端序列(圖2)。樹鼩與人(Homosapiens)、食蟹猴(Macacafascicularis)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)、豬(Susscrofa)、狗(Canislupus)、黑猩猩(Pantroglodytes)、兔(Oryctolaguscuniculus)的同源相似性分別為97.3%、97.3%、97.4%、97.1%、97.9%、97.4%、97.4%、97.1%。

在基于核酸序列和氨基酸序列構(gòu)建的NJ進化樹中，觀察到一個與基于已知序列和基因組序列獲得的進化樹相同的聚類模式，樹鼩與靈長類顯示出一個較近的親緣關(guān)系(圖3)，獲得的進化結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖2 樹鼩與其他親緣較近的8種脊椎動物APP氨基酸序列的比對結(jié)果Fig.2 Alignment of the APP amino acid sequences in 9 vertebrate species

圖3 分別基于氨基酸序列(A)、核酸序列(B)的進化樹Fig.3 Phylogenetic trees of the IL7 gene based on amino acid sequences (A) and deduced nucleotide sequences (B)

2.3 樹鼩APP蛋白與人APP蛋白三維結(jié)構(gòu)比對

通過三維建模，樹鼩和人的APP基因分別有4個結(jié)構(gòu)域：半胱氨酸豐富的球狀區(qū)E1；KPI區(qū)；α螺旋豐富的E2區(qū)，包含了一部分的Aβ，延伸至跨膜區(qū)；跨膜區(qū)和C末端信號轉(zhuǎn)導區(qū)。12個差異氨基酸位于無規(guī)則卷曲中，8個差異氨基酸位于E1區(qū)和KPI區(qū)中，而E2區(qū)和跨膜信號區(qū)高度同源保守，沒有差異氨基酸，可能和維持功能相關(guān)(圖4)。

2.4 APP基因mRNA各種剪接體的序列比對

為確認樹鼩中所有的APP基因的可變剪接體，我們對從不同組織中獲得的總RNA中的大量cDNA克隆進行測序，除了以上提到的完整的典型的APP770剪接體，我們還確認了其他3種不同的APP基因可變剪接體(圖5，基因ID號：KY399768～KY399771)。通過序列間的比對確認了這4種通過外顯子跳躍產(chǎn)生的APP可變剪接體，包括APP770，APP695，APP751，APP677四種。

2.5 APP mRNA和各可變剪接體的表達模式

定量PCR的方法確認了APP所有剪接體在10個樹鼩不同組織中的表達情況，4種剪接體均表達于肺、腎和腸，APP695和APP677在心臟、肝、脾、肌肉、腎上腺中共表達，APP751和APP695在大腦、小腦、海馬和睪丸中共表達，睪丸中還表達APP677，脊髓中單獨表達APP695，脂肪中單獨表達APP770，APP770主要在肌肉中分布(圖6)。

圖4 樹鼩(A)和人(B)的APP蛋白三維建模Fig.4 Structure of APP in the tree shrew (A) and humans (B)

圖5 樹鼩APP基因mRNA及其可變剪接體的示意圖Fig.5 Schematic structure of APP mRNA and its transcripts in Chinese tree shrew

注：A：大腦；B：小腦；C：海馬；D：脊髓；E：心臟；F：肝；G：脾；H：肺；I：腎；J：肌肉；K：腎上腺；L：腸；M：睪丸；N：脂肪。圖6 樹鼩APP基因在不同組織的分布(左)及相對表達量(右)Note. A. Brain；B. Cerebellum；C. Hippocampus；D. Spinal cord；E. Heart；F. Liver；G. Spleen；H. Lung；I. Kidney；J. Muscle；K. Adrenal gland；L. Intestine；M. Testis；N. Adipose tissue.Fig.6 Distribution patterns of APP(left)and its transcripts expression levels in different tissues(right)

3 討論

APP具有促進細胞增生和神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，在細胞膜上是一種跨膜糖蛋白，通過與細胞膜外基質(zhì)的相互作用介導神經(jīng)細胞之間的粘附，增加神經(jīng)突觸之間的聯(lián)系及突觸可塑性。APP可能通過作用于細胞表面的特異受體來刺激軸突的發(fā)生和生長，APP通過蛋白酶剪切后產(chǎn)生的Aβ，長久以來一直被認為是導致AD產(chǎn)生的最根本原因。因此，影響APP剪切的重要因素(包括APP基因的結(jié)構(gòu)、基因的序列和突變、可變剪接體的存在形式和分布)一直是研究的熱點[12, 13]，目前，人[14]、大鼠[15]、小鼠[16]等物種中的APP基因及所有的可變剪接體都已經(jīng)有報道，而被認為是理想癡呆模型動物的樹鼩的APP基因僅有其中的一種剪接體APP695有報道，以及鳥槍法測序預(yù)測獲得的六種可變剪接體，這些信息還遠遠不夠。

因此，本研究旨在區(qū)分并鑒定樹鼩APP mRNA的所有可變剪接體，在對這一與AD疾病發(fā)生和進展密切相關(guān)的關(guān)鍵分子的基因進行特征描述的基礎(chǔ)上，再結(jié)合可變剪接體的分布情況進一步調(diào)查APP基因在不同組織中的表達量。本研究首次獲得了APP最長的可變剪接體APP770的分子序列，并通過blast獲得的同源性最高的9種物種中進行序列比對分析，結(jié)果表明，樹鼩特異的氨基酸有5個，分別是第12位的V、 193位的N、 254位的A、 301位的Q、 354位的W。有趣的是，N末端的序列同源性較低，而C末端的長達143氨基酸的序列以及A基的序列與人的完全一致。

在基于核酸序列和氨基酸序列構(gòu)建的NJ進化樹中，發(fā)現(xiàn)一個與基于已知序列和基因組序列獲得的進化樹相同的聚類模式，樹鼩與豬和狗更為接近，在進化上處于同一分支，而人、黑猩猩和猴最為接近，在進化上處于同一分支，大小鼠和兔最為接近，在進化上處于同一分支，樹鼩與靈長類顯示出一個較近的親緣關(guān)系(圖3)，獲得的進化結(jié)果穩(wěn)定可靠。

通過三維建模，樹鼩和人的APP基因三維結(jié)構(gòu)非常類似，分別有4個結(jié)構(gòu)域：半胱氨酸豐富的球狀區(qū)E1；KPI區(qū)；α螺旋豐富的E2區(qū)，包含了一部分的Aβ，延伸至跨膜區(qū)；跨膜區(qū)和C末端信號轉(zhuǎn)導區(qū)。共20個的差異氨基酸中，12個差異氨基酸位于無規(guī)則卷曲中，8個差異氨基酸位于E1區(qū)和和KPI區(qū)中，而E2區(qū)和跨膜信號區(qū)高度同源保守，沒有差異氨基酸，可能和維持功能相關(guān)，這個區(qū)域中有與AD發(fā)病最為相關(guān)的Aβ分子編碼區(qū)，可以看到，此次測序的結(jié)果與之前的一樣，樹鼩的Aβ序列與人的完全一致，而大小鼠存在3個氨基酸的差異，這可能與老年樹鼩腦中可以形成SP有關(guān)。

為確認樹鼩中所有的APP基因的可變剪接體，對從不同組織中獲得的總RNA中的大量cDNA克隆進行測序，除了以上提到的完整的典型的APP770剪接體，還確認了其他3種不同的APP基因可變剪接體(圖4，基因ID號：KY399768～KY399771)。同時確認了這4種通過外顯子跳躍產(chǎn)生的APP可變剪接體在不同組織中的分布(圖5)，包括APP770、APP695、APP751、APP677四種。在之前公布的樹鼩基因組序列中，預(yù)測獲得了6種可變剪接體，排除了由于技術(shù)限制未能測到的35個氨基酸的N末端和一個544位點的FFF序列檢測為SLSL而多一個氨基酸之外，預(yù)測得到的其實為：所有外顯子(APP770)，缺外顯子8(APP751)，7和8(APP695)，8和15(APP733)，7、8和15(APP677)，15(APP752)六種類似人的可變剪接體，經(jīng)過實驗檢測，僅驗證了四種的存在，沒有APP733和APP752的存在。

APP剪接體的分布有組織特異性，4種剪接體均表達的是肺、腎和腸，APP695和APP677在心臟、肝、脾、肌肉、腎上腺中共表達，APP751和APP695在大腦、小腦、海馬和睪丸中共表達，睪丸中還表達APP677，脊髓中單獨表達APP695，脂肪中單獨表達APP770。選擇性剪切得到的可變剪接體通常具有組織特異性，并在特定組織和發(fā)育階段起著關(guān)鍵作用，本研究結(jié)果和之前的結(jié)果類似，APP695主要在腦中分布，但肌肉中未檢測到APP770的存在可能是受到了技術(shù)的限制。其表現(xiàn)的共表達方式也很可能與功能相關(guān)。同時，通過定量PCR確定表達量最高的是肺、肌肉和睪丸，大腦、小腦和脊髓等神經(jīng)組織中表達量中等。

總之，本研究首次確認了樹鼩APP基因的可變剪接體的分型和表達模式，提示樹鼩有可能是作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想動物。

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Characterization of tree shrew APP gene and identification of its alternatively spliced variants

HAN Yuan-yuan, SUN Xiao-mei, KUANG De-xuan, LU Cai-xia, CHEN Ling-xiaTONG Pin-fen, WANG Wen-guang, LI Na, DAI Jie-jie*

(Center of Tree Shrew Germplasm Resources, Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College. Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases.Yunnan Innovation Team of Standardization and Application Research on Tree Shrew.Kunming 650118, China )

Objective The aim of this study was to differentiate and identify all the variants of APP mRNA in tree shrew, describe the characteristics of APP genes, and determine its distribution in different tissues. Method Based on the known human APP sequence and predicted tree shrew APP gene, we designed a pair of common specific primer. We extracted total RNA from different tissues respectively, using RT-PCR to get the targeted cDNA. We differentiated the variants by electrophoresis. Finally we recollected the RT-PCR products for sequencing. Combined with the qPCR results, we confirmed the quantitative distribution of the variants in different tissues. Results Our sequencing results showed that the length of the tree shrew APP spliceosome was 3514 bp with a 109 bp 5′-UTR and a 1092 bp3′-UTP. APP genes in the investigated 9 species were highly homologous and conservative, tree shrews and primates show a very close genetic relationship. The tree shrew APP genes shared four domains by 3D modeling. We also confirmed the distribution pattern of 4 spliceosomes derived from exon jumping. All existed APP variants, including APP770, APP695, APP751, and APP677, were all expressed in the lung, kidney and intestine. The highest expression levels were in the lung, muscle, and testicles. Conclusions This study helps to promote the studies of tree shrews as an Alzheimer’s disease model and the mechanism of its pathogenesis and drug development.

TupaiaBelangeri; APP mRNA variants; APP distribution; Alzheimer’s disease model

DAI Jie-jie, E-mail: djj@imbcams.com.cn

國家科技支撐計劃項目 (2014BAI01B00)；云南省聯(lián)合支持國家計劃項目(2015GA009)；云南省科技人才和平臺計劃項目。

罕園園(1983年-)，女，助理研究員。E-mail: hyy@imbcams.com.cn

代解杰，男，項目負責人。E-mail： djj@imbcams.com.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0132-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.004

2017-01-04