侯林，許晟迪，張柱霞，田小莉，姜樹原，劉友，巴德仁貴，黃麗華*，邵國,3*

(1. 包頭醫(yī)學院中心實驗室生物醫(yī)學研究中心，基礎(chǔ)學院，包頭醫(yī)學院神經(jīng)科學研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3.首都醫(yī)科大學 宣武醫(yī)院 低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學北京重點實驗室，北京 100053)

研究報告

PP1γ基因DNA甲基化在學習記憶中的作用

侯林1,2#，許晟迪1,2#，張柱霞1,2，田小莉1,2，姜樹原1,2，劉友1,2，巴德仁貴1,2，黃麗華1,2*，邵國1,2,3*

(1. 包頭醫(yī)學院中心實驗室生物醫(yī)學研究中心，基礎(chǔ)學院，包頭醫(yī)學院神經(jīng)科學研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3.首都醫(yī)科大學 宣武醫(yī)院 低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學北京重點實驗室，北京 100053)

目的 研究蛋白磷酸酶1γ(protein serine/threonine phosphatase, PP1γ)和DNA甲基化在學習記憶中的作用。方法 通過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methytransferases，DNMTs)抑制劑5-aza-cdR處理小鼠，觀察小鼠學習記憶情況及其PP1γ表達變化，通過水迷宮測定小鼠的學習記憶能力，Real-time PCR 檢測小鼠海馬區(qū)DNMTs和PP1γmRNA轉(zhuǎn)錄水平以及Western-Blot測定PP1γ的蛋白質(zhì)表達水平。為了進一步探討5-aza-cdR對小鼠學習記憶的影響是否與細胞增殖和凋亡有關(guān)，用5-aza-cdR 處理NG108-15神經(jīng)細胞，流式細胞儀、xCelligence系統(tǒng)和熒光素酶報告基因分別檢測5-aza-cdR對細胞增殖、凋亡和PP1γ的轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果 側(cè)腦室注射了5-aza-cdR的小鼠空間學習記憶能力增加，同時小鼠海馬區(qū)的DNMTs和PP1γ的表達降低；10 μmol/L 5-aza-cdR抑制細胞增殖，降低PP1γ的轉(zhuǎn)錄活性，但是沒有誘導(dǎo)細胞凋亡。結(jié)論 5-aza-cdR對PP1γ的表達抑制與小鼠學習記憶有關(guān)。

蛋白磷酸酶1γ；5-aza-cdR；海馬；學習記憶

神經(jīng)元的基因轉(zhuǎn)錄在學習和記憶的形成中是必須的[1]。而控制該轉(zhuǎn)錄的分子機制非常復(fù)雜，其中包括蛋白激酶和蛋白磷酸酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[2]。蛋白磷酸酶1γ(protein serine/threonine phosphatase, PP1)在調(diào)節(jié)染色體重塑過程中控制轉(zhuǎn)錄依賴性記憶調(diào)節(jié)行為發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。它是大腦中的第二豐富的酶，包含4個表達不同的亞基(α, β, γ和δ)。其中PP1α主要表達在細胞質(zhì)中，PP1β和PP1δ在胞質(zhì)和胞核中均有表達，PP1γ顯著表達于細胞核中[4]。這4種亞基依賴它們的亞細胞定位和相互作用基團，而定位作用于不同底物。PP1γ的研究最為廣泛，不僅在大腦中對神經(jīng)元信號和突觸強度發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用[5-7]，同時被認為是學習和記憶抑制性分子[8]。但是，PP1γ在調(diào)節(jié)學習記憶中的表達調(diào)控的分子機制到目前為止還沒有完全明確。

學習記憶的形成涉及一系列細胞和分子的改變[9],包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和突觸可塑性。DNA甲基化是表觀遺傳學中主要形式之一，在基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Day等[10]的研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化顯著促進學習記憶的形成。催化DNA甲基化的形成的酶稱為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)，主要包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B，與非催化亞基DNMT3L在配子、胚胎和體細胞組織的形成與發(fā)展中建立特定的DNA甲基化模型。同時，富含GC的PP1γ啟動子區(qū)的甲基化水平影響其表達[11]。

5-aza-cdR是一種核苷酸類的甲基化抑制劑，它主要通過抑制DNA甲基化的轉(zhuǎn)錄表達而影響DNA的表達水平，而被廣泛的應(yīng)用于研究DNA甲基化[12-14]。DNA甲基化在神經(jīng)發(fā)育和分化、學習記憶中的突觸可塑性都扮演重要角色[15-18]，因此本研究通過5-aza-cdR處理小鼠和細胞來探討PP1γ的甲基化和學習記憶之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡SPF級雄性ICR小鼠，體重(18～22) g，86只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2011-0012]。無菌手術(shù)在包頭醫(yī)學院低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學內(nèi)蒙古重點實驗室進行[19][SYXK (蒙) 2016-1017]。

1.2 試劑儀器

5-aza-cdR (美國Sigma-Aldrich公司)，牛血清白蛋白(中國上海晨達醫(yī)藥科技有限公司)，巴比妥鈉(中國重慶化學試劑廠)，Trizol (日本Takara公司)，Superscript III試劑盒(美國Invitrogen公司)，RIPA(中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，BCA試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，DMEM完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，青鏈霉素(美國Gibco公司)，F(xiàn)ITC annexin V Apoptosis Detection Kit II(美國BD公司)，pGL-3載體(美國Promega公司)，Dual-Glo熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)，大腦立體定位注射儀(中國瑞沃德生命科學技術(shù)有限公司)，水迷宮裝置(中國北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)，核酸蛋白分析儀NanoDrop 2000(美國Thermo Fisher公司)，實時熒光定量Real-time PCR儀(美國Thermo Fisher公司)，酶標儀(美國Thermo Fisher公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，熒光倒置顯微鏡TE2000-U(日本Nikon公司)，細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)，xCELLigence系統(tǒng)(中國杭州艾森生物公司)，流式細胞儀BD FA CSCantoTM II(美國BD公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠側(cè)腦室注射

小鼠側(cè)腦室注射方法改進于Haley和McCormick的方法[20]。5-aza-cdR溶解在無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，使用前稀釋至10 μmol/L。1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，固定于大腦立體定位注射儀上，頭頂部去毛，消毒皮膚，在頭頂部正中切口，暴露前囟。依據(jù)小鼠立位解剖圖譜，于前囟后0.5 mm，中線右側(cè)1 mm，垂直進針，深度2.5 mm。實驗組向右側(cè)腦室緩慢注入5 μL 10 μmol/L 5-aza-cdR，每次注射時間為5 min，留針2 min，保證藥物充分被吸收，緩慢退針。對照組注射等體積的0.1%的牛血清白蛋白[21]。皮膚切口處用青霉素抗菌，縫合傷口。

1.3.2 水迷宮測試

水迷宮實驗方法模仿其他課題組的操作[22]，連續(xù)訓練5 d。訓練完成后，小鼠隨機分成2組，每組43只，分別側(cè)腦室注射5-aza-cdR和BSA，休息1 d后，再次進行水迷宮測試，水下平臺移至前一階段放置位置的對面象限，連續(xù)訓練5 d，每天4個象限，記錄每只小鼠找到平臺的時間，檢測小鼠的學習記憶能力。

1.3.3 Real-time PCR檢測小鼠海馬中DNMTs和PP1γ的mRNA表達水平

Trizol法分離小鼠海馬中的總RNA并利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，于-20 ℃保存。引物由Invitrogen公司合成，引物序列參見Zhang[23]的文章。Q-PCR結(jié)果利用ΔΔCT法進行分析，ΔCT=CT目標基因- CTbeta-actin，mRNA相對豐度值F=ΔΔCT=2-ΔCT。

1.3.4 蛋白印跡

RIPA法提取小鼠海馬中的總蛋白。BCA試劑盒檢測總蛋白質(zhì)的濃度，上樣量為20 μg。Western-blot檢測PP1γ和beta-actin在小鼠海馬中的含量，方法如同本課題組Zhang[23]等。最后通過蛋白質(zhì)凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像并分析其灰度值。

1.3.5 細胞培養(yǎng)和5-aza-cdR處理

0.6%青鏈霉素和10%胎牛血清的 DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠神經(jīng)細胞NG108-15，培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為37℃、95%濕度和5% CO2。細胞融合度達到60%左右時，去掉舊培養(yǎng)基，重新補加含有5-aza-cdR或BSA的新培養(yǎng)基，孵育24 h。

1.3.6 xCELLigence系統(tǒng)(RTCA)實時監(jiān)測細胞增殖

NG108-15細胞株在進行細胞增殖實驗前一天進行細胞傳代，當細胞融合度在60%～80%之間，從培養(yǎng)箱中取出細胞，懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度達每孔8000個，接種在16孔板中。E-plate置于儀器檢測臺上測試培養(yǎng)基的基線。上室孔中加入細胞懸液，室溫放置30 min。測定24 h內(nèi)細胞貼壁生長情況。0、5、10、20 μmol/L的5-aza-CdR藥物分別處理細胞，每15 min記錄一次細胞的增殖指數(shù)(CI)，連續(xù)監(jiān)測5 d。

1.3.7 流式細胞儀監(jiān)測細胞凋亡

收集6孔板中的細胞，冰冷的PBS洗2遍，1 mL的1× binding緩沖液懸浮細胞，轉(zhuǎn)移100 μL細胞懸液至BD管中，然后每個BD管中加入2 μL的FITC annexin V和2 μL PI嚴格按照說明書的方法進行操作，最后使用流式細胞儀監(jiān)測細胞的凋亡變化情況。

1.3.8 熒光素酶報告基因檢測

PP1γ啟動子區(qū)(-1 bp至-420 bp)插入pGL-3載體，然后轉(zhuǎn)染細胞。通過Dual-Glo熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測其活性表達，Renilla標準化其活性。

1.3.9 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差表示，用SPSS 10.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件ANOVA和Tukey對組間數(shù)據(jù)進行處理和分析。P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 5-aza-cdR增加小鼠空間學習記憶能力

通過水迷宮方法檢測5-aza-cdR對小鼠學習記憶能力的影響。記錄小鼠在2 min內(nèi)找到水下1 cm隱藏平臺的時間，我們發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，大腦立體定位注射了5-aza-cdR的小鼠找到平臺的時間明顯縮短，尤其是在第2、3、4天，差異有顯著性(P<0.05)(如圖1)，而其游泳的速度沒有變化，表明5-aza-cdR明顯提高了小鼠學習記憶能力。

注：*P<0.05，n =43。圖1 水迷宮測定小鼠空間學習記憶能力Note. *P<0.05, n=43 for each group.Fig.1 The results of Morris water maze tests show that 5-aza-cdR decreased the escape latency for mice, as a criterion for spatial memory

2.2 5-aza-cdR下調(diào)小鼠海馬中DNMTs的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變現(xiàn)情況如圖2所示。與對照組相比，5-aza-cdR處理的小鼠海馬中DNMTs的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(P<0.05)。

注：A：DNMT1(*P=8.0E-4<0.05)；B：DNMT3A(*P=1.5E-2<0.05)；C：DNMT3C (*P=2.9E-2<0.05)；n=4。圖2 Real-time PCR 分析小鼠海馬中DNMTs的表達變化情況Note. A: DNMT1; B: DNMT3A; C: DNMT3C; n=4.Fig.2 Real-time PCR analysis for the expression of DNMTs in the mouse hippocampus

2.3 5-aza-cdR下調(diào)小鼠海馬中PP1γ的轉(zhuǎn)錄和表達水平

注：A：*P=5.0E-4<0.05，n=3；B：*P=3.1E-2<0.05，n=3。圖3 PP1γ mRNA表達變化情況和小鼠海馬區(qū)PP1γ蛋白質(zhì)表達變化Note. A: *P=5.0E-4<0.05, n=3; B: *P=3.1E-2<0.05, n=3.Fig.3 Expression of PP1γ mRNA and Western blot analysis of PP1γ expression in the mouse hippocampus

小鼠大腦立體定位注射了5-aza-cdR后，檢測海馬中PP1γ的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平，結(jié)果如圖3所示。圖3A顯示：5-aza-cdR 明顯下調(diào)PP1γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，差異有顯著性(P<0.05)；圖3B顯示：5-aza-cdR明顯降低PP1γ的蛋白質(zhì)表達水平，差異有顯著性(P<0.05)。

2.4 RTCA檢測細胞增殖

xCELLigence RTCA檢測5、10和20 μmol/L濃度的5-aza-cdR對NG108-15細胞增殖的抑制作用。我們發(fā)現(xiàn)5-aza-cdR對細胞增殖有明顯的抑制作用，且表現(xiàn)為濃度依賴性，如圖4A所示。當5-aza-cdR的濃度達到10 μmol/L時，NG108-15細胞增殖基本完全被抑制，因此此濃度作為該實驗的最佳選擇濃度。與對照組相比，5-aza-cdR明顯抑制NG108-15細胞增殖，差異有顯著性(P<0.05)，如圖4B所示。

2.5 5-aza-cdR促進NG108-15細胞的凋亡

為了進一步驗證5-aza-cdR對細胞增殖的影響，我們通過流式細胞儀檢測5-aza-cdR對細胞凋亡影響，結(jié)果顯示10 μmol/L的5-aza-cdR對早期和晚期凋亡的影響沒有顯著性(圖5,P>0.05)。

圖4 RTCA 分析5-aza-cdR對神經(jīng)細胞NG108-15細胞增殖的抑制作用Fig.4 RTCA analysis for the proliferation of NG108-15 cells treated with different concentrations of 5-aza-cdR

注：A：表示對照組細胞的凋亡變化情況；B：表示的5-aza-cdR處理后細胞的凋亡變化情況；C：表示的是兩組處理情況下細胞的早期和晚期凋亡的柱狀圖。圖5 流式細胞儀檢測細胞的凋亡變化情況Note. The upper panels show the apoptosis in NG108-15 cells in the control group (A) and test group (B); C: Apoptosis in NG108-15 cells.Fig.5 FCM analysis for the apoptosis in 5-aza-cdR-treated NG108-15 cells

2.6 5-aza-cdR抑制NG018-15細胞中PP1γ的轉(zhuǎn)錄活性

研究5-aza-cdR對PP1γ啟動子區(qū)(-1 bp到-420 bp)轉(zhuǎn)錄活性的影響，PP1γ啟動子區(qū)和pGL-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到pRL-TK。海腎熒光素酶活性作為對照來檢測PP1γ啟動子區(qū) 熒光素酶活性。如圖6所示，與對照組相比，5-aza-cdR可以明顯的降低PP1γ啟動子區(qū)的活性(P<0.05)。

注：* P=5.0E-2<0.05，n=3。圖6 5-aza-cdR 下調(diào)PP1γ啟動子區(qū)活性Note. * P=5.0E-2<0.05, n=3.Fig.6 5-aza-cdR down-regulates PP1γ promoter activity

3 討論

表觀遺傳學修飾是影響大腦突觸可塑性形成的關(guān)鍵因素，其中DNA甲基化的研究最為廣泛。DNA甲基化在學習記憶的形成中發(fā)揮著重要的作用[24]。Sweatt[25]和他的同事已經(jīng)證明DNA甲基化的動態(tài)改變在長時程記憶形成中是必須的。研究顯示DNA甲基化在調(diào)節(jié)突觸可塑性和學習記憶中發(fā)揮著舉足輕重的作用[26]。DNA甲基化影響神經(jīng)元的可塑性，注射了甲基化抑制劑后動物恐懼水平降低[11]。隨著研究的不斷進展，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在大腦發(fā)育和神經(jīng)元功能中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[23,27]。這些研究進一步證明了DNA甲基化在學習記憶中的關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化抑制劑5-aza-cdR明顯抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，同時它對小鼠的空間學習記憶能力明顯提高。結(jié)果顯示了DNA甲基化可能是與學習記憶能力關(guān)系密切。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠側(cè)腦室注射10 μmol/L的5-aza-cdR可以增加小鼠空間學習記憶能力，顯示這種變化可能與某些分子甲基化的改變有關(guān)。前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)，DNMTs的降低伴隨著PP1γ的表達降低[28]。PP1與學習記憶的形成有關(guān)，可能涉及與學習記憶相關(guān)的靶基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)，被認為是海馬中突觸強度和突觸可塑性負性調(diào)節(jié)因子和成年鼠中潛在的記憶抑制劑[8,26]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠海馬和細胞模型中，DNA甲基化抑制劑5-aza-cdR抑制PP1γ的表達和轉(zhuǎn)錄活性。另一方面，PP1γ可能通過其磷酸化作用影響某些高級特殊行為的突觸傳輸。雖然PP1γ的DNA甲基化的機制還沒有完全闡述明白，但是我們已經(jīng)明確PP1γ表達降低可能與提高學習記憶能力有關(guān)。

為了進一步明確5-aza-cdR對學習記憶的影響與細胞的增殖和凋亡的關(guān)系。我們進一步選擇了NG108-15細胞作為體外模型進行研究。通過增殖曲線，我們發(fā)現(xiàn)當5-aza-cdR的濃度達到10 μmol/L時，細胞增殖基本完全被抑制。由于5-aza-cdR沒有明顯促進細胞的早期和晚期凋亡。因此我們推斷5-aza-cdR促進小鼠學習記憶與新神經(jīng)元的形成無關(guān)和凋亡無關(guān)。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，5-aza-cdR明顯降低了NG108-15細胞中PP1γ的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)合體外細胞實驗和小鼠體內(nèi)實驗，5-aza-cdR促進小鼠學習記憶可能與PP1γ的改變有關(guān)。5-aza-cdR作為DNMTs抑制劑，能夠降低DNA的甲基化程度。有研究發(fā)現(xiàn)低甲基化是保持大腦內(nèi)基因表達穩(wěn)定的需要[22]。但是我們發(fā)現(xiàn)5-aza-cdR降低了小鼠海馬區(qū)PP1γ的表達和神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)錄活性，其中可能涉及一些分子機制的改變。通過該研究，我們還不能確定5-aza-cdR對PP1γ的影響是否是與DNMTs有關(guān)。

PP1γ甲基化變化和學習記憶的關(guān)系還未見到相關(guān)的報道。我們的研究首次報道了成年小鼠海馬PP1γ在5-aza-cdR對學習記憶和突觸可塑性的形成中扮演著重要的角色。因此PP1γ低表達對學習記憶的影響可能與DNA甲基化有很大關(guān)系。

[1] Capitano F, Gargiuli C, Angerilli A, et al. RNA polymerase I transcription is modulated by spatial learning in different brain regions [J]. J Neurochem, 2016，136(4): 706-716.

[2] Chagniel L, Bergeron Y, Bureau G, et al. Regulation of tyrosine phosphatase STEP61 by protein kinase A during motor skill learning in mice [J]. Plos One, 2014, 9(1): e86988.

[3] Day JJ, Sweatt JD. DNA methylation and memory formation [J]. Nature Neurosci, 2010, 13(11): 1319-1323.

[4] Desjobert C, El Mai M, Gérard-Hirne T, et al. Combined analysis of DNA methylation and cell cycle in cancer cells [J]. Epigenetics, 2015, 10(1): 82-91.

[5] Einstein F, Thompson R F, Bhagat T D, et al. Cytosine methylation dysregulation in neonates following intrauterine growth restriction [J]. Plos One, 2010, 5(1): e8887.

[6] Frühwald MC, Plass C. Global and gene-specific methylation patterns in cancer: aspects of tumor biology and clinical potential [J]. Mol Genet Metab, 2002, 75(1): 1-16.

[7] Genoux D, Haditsch U, Knobloch M, et al. Protein phosphatase 1 is a molecular constraint on learning and memory [J]. Nature, 2002, 418(6901): 970-975.

[8] Gr?ff J, Koshibu K, Jouvenceau A, et al. Protein phosphatase 1-dependent transcriptional programs for long-term memory and plasticity [J]. Learn Mem, 2010, 17(7): 355-363.

[9] Gros A, Veyrac A, Laroche S. [Brain and memory: new neurons to remember] [J]. Biologie Aujourdhui, 2015, 209(3): 229-248.

[10] Hédou GF, Koshibu K, Farinelli M, et al. Protein phosphatase 1-dependent bidirectional synaptic plasticity controls ischemic recovery in the adult brain [J]. J Neurosci, 2008, 28(1): 154-162.

[11] Isaac J. Protein phosphatase 1 and LTD: synapses are the architects of depression [J]. Neuron, 2002, 32(6): 963-966.

[12] Kennedy A J, Sweatt J D. Drugging the methylome: DNA methylation and memory.[J]. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2016: 51(3): 185-194

[13] Li S, Goorha S, Ballou LR, et al. Intracerebroventricular interleukin-6, macrophage inflammatory protein-1beta and IL-18: pyrogenic and PGE(2)-mediated? [J]. Brain Res, 2003, 992(1): 76-84.

[14] Miller CA, Campbell SL, Sweatt JD. DNA methylation and histone acetylation work in concert to regulate memory formation and synaptic plasticity [J]. Neurobiol Learn Mem, 2008, 89(4): 599-603.

[15] Miller CA, Sweatt JD. Covalent modification of DNA regulates memory formation [J]. Neuron, 2007, 53(6): 857-869.

[16] Morishita W, Connor JH, Xia H, et al. Regulation of synaptic strength by protein phosphatase 1[J]. Neuron, 2002, 32(6): 1133-1148.

[17] Nelson ED, Kavalali ET, Monteggia LM. Activity-dependent suppression of miniature neurotransmission through the regulation of DNA methylation [J]. J Neurosci, 2008, 28(2): 395-406.

[18] Nguyen S, Konstantinos Meletis, Fu D, et al. Ablation of de novo DNA methyltransferase Dnmt3a in the nervous system leads to neuromuscular defects and shortened lifespan [J]. Dev Dyn, 2007, 236(6): 1663-1676.

[19] 張建軍, 隋欣, 呂國蔚, 等. 化學預(yù)處理對低氧預(yù)適應(yīng)模型小鼠的影響 [J]. 中國組織工程研究, 2012, 46: 8698-8702.

[20] Noguchi H, Kimura A, Murao N, et al. Expression of DNMT1 in neural stem/precursor cells is critical for survival of newly generated neurons in the adult hippocampus[J]. Neurosci Res, 2015, 95: 1-11.

[21] Nugent BM, Wright CL, Shetty AC, et al. Brain feminization requires active repression of masculinization via DNA methylation [J]. Nature Neurosc, 2015, 18(5): 1823-1824.

[22] Rajendran G, Shanmuganandam K, Bendre A, et al. Epigenetic regulation of DNA methyltransferases: DNMT1 and DNMT3B in gliomas [J]. J Neurooncol, 2011, 104(2): 483-494.

[23] Zhang S, Zhang Y, Jiang S, et al. The effect of hypoxia preconditioning on DNA methyltransferase and PP1γ in hippocampus of hypoxia preconditioned mice [J]. High Altitude Med Biol, 2014, 15(4): 483-490.

[24] 姚志剛, 秦川. 表觀遺傳修飾在學習和記憶中的調(diào)節(jié)作用 [J]. 中國實驗動物學報, 2011, 19(5): 441-445.

[25] Strack S, Kini S, Ebner FF, et al. Differential cellular and subcellular localization of protein phosphatase 1 isoforms in brain [J]. J Comp Neurol, 1999, 413(3): 373-384.

[26] Ulke-Lemée A, Trinkle-Mulcahy L, Chaulk S, et al. The nuclear PP1 interacting protein ZAP3 (ZAP) is a putative nucleoside kinase that complexes with SAM68, CIA, NF110/45, and HNRNP-G J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1774(10): 1339-1350.

[27] Zhang D, Li Q, Rao L, et al. Effect of 5-Aza-2′-deoxycytidine on odontogenic differentiation of human dental pulp cells [J]. J Endodont, 2015, 41(5): 640-645.

[28] Zhou R, Chen F, Chang F, et al. Persistent overexpression of DNA methyltransferase 1 attenuating GABAergic inhibition in basolateral amygdala accounts for anxiety in rat offspring exposed perinatally to low-dose bisphenol A [J]. J Psychiat Res, 2013, 47(10): 1535-1544.

Effect of expression ofPP1γand DNA methylation on learning and memory in mice

HOU Lin1,2#, XU Sheng-di1,2#, ZHANG Zhu-xia1,2, TIAN Xiao-li1,2, JIANG Shu-yuan1,2, LIU You1,2, BADE Rengui1,2, HUANG Li-hua1,2*, SHAO Guo1,2,3*

(1.Biomedicine Research Center, Basic Medical College and Neuroscience Institute, Baotou Medical College, Baotou, Inner Mongolia 014010, China; 2.Inner Mongolia Key Laboratory of Hypoxic Translational Medicine, Baotou Medical College, Baotou, Inner Mongolia 014010; 3. Beijing Key Laboratory of Hypoxia AdaptationTranslational Medicine, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053)

Objectives To study the role of protein serine/threonine phosphatase1γ (PP1γ) and DNA methylation in learning and memory. Methods The mice and cells were treated with 5-aza-cdR, a DNA methyltransferase (DNMT) inhibitor, and to observe the changes of ability of learning and memory and expression levels ofPP1γin mice. The ability of learning and memory in mice was assessed by Morris Water maze test. The mRNA expression levels ofDNMTsandPP1γin the mouse hippocampus were determined by real-time PCR and the protein level of PP1γ was measured by Western blot. To further investigate their role, NG108-15 cell line was treated with 5-aza-cdR. Flow cytometry, xCelligence and luciferase were used to detect the effects of 5-aza-cdR on the proliferation, apoptosis andPP1γtranscription in the NG108-15 cells. Results The ability of learning and memory was enhanced in the mice after administration of 5-aza-cdR injection. The expressions of DNMTs and PP1γ were decreased in the mouse hippocampus after injection of 5-aza-cdR. On the other side, 10 μmol/L 5-aza-cdR inhibited cell proliferation and decreasedPP1γtranscription without inducing apoptosis. Conclusions Our data demonstrate that 5-aza-cdR inhibits the expression of PP1γ which is related to learning and memory in mice.

PP1γ; 5-aza-cdR; Hippocampus; Learning and memory

SHAO Guo, E-mail: shao_guo_china@163.com；HUANG Li-hua，E-mail: huanglihua858@163.com

國家自然科學基金(Nos: 81460283, 81660307)；內(nèi)蒙古自然科學基金 (No: 2014MS0810)。

侯林(1992-)，男，碩士研究生，專業(yè)：公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學， E-mail： holy.lin@foxmail.com；許晟迪(1992-)，女，碩士研究生，專業(yè)：神經(jīng)生物學， E-mail： 2219984188@qq.com。共同第一作者

邵國，男，教授，研究方向：神經(jīng)生物學， E-mail: shao_guo_china@163.com; 黃麗華，女，副教授，研究方向：神經(jīng)毒理學，E-mail: huanglihua858@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0146-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.006

2016-08-30