薛愛娟 苗士建 孫 樺 仇曉霞 王勝楠 黃 瑛

炎癥性腸病(IBD)是一組慢性復發(fā)性腸道炎性疾病，發(fā)病年齡<6歲的IBD稱為極早發(fā)型IBD(VEO-IBD)。VEO-IBD是兒童IBD的一種特殊亞型，占兒童IBD的4%～10%，常可檢測到基因缺陷[1]?？芍翴BD樣表型的單基因突變中，以IL10及IL10R的功能缺失性突變最為常見[2]。IL10R由2個亞單位構(gòu)成，分別由IL10RA及IL10RA編碼。我國VEO-IBD的基因缺陷以IL10RA突變最為常見[3, 4]。IL10RA基因功能缺陷的VEO-IBD患兒多有結(jié)腸累及，且結(jié)腸病變重；而消化道中又以結(jié)腸部位細菌數(shù)量居多，提示腸道菌群在IL10RA基因功能缺陷患兒的腸道炎癥發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮作用[3, 4]。然而，目前尚無基于16S rRNA基因測序方法對IL10RA基因功能缺陷患兒腸道菌群組成的描述。

1 方法

1.1 研究設計 以復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)消化科病房和門診為橫斷面調(diào)查現(xiàn)場，納入IL10RA基因功能缺陷致VEO-IBD患兒(IL10RA組)、未檢測到基因功能缺陷的類似癥狀患兒(癥狀組)及年齡匹配的健康兒童(健康組)，采用16SrRNA基因測序方法檢測并分析3組人群糞便樣本的菌群組成及多樣性。

1.2 倫理 本研究方案獲得我院倫理委員會批準。

1.3IL10RA基因突變的診斷方法和標準 外周血提取的基因組DNA經(jīng)過全外顯子檢測(WES)和Sanger測序驗證，存在可以解釋臨床表型的致病性突變，且為已報道過的致基因功能缺失的突變位點。

1.4IL10RA組和癥狀組納入標準 ①我院消化科就診的0～5歲兒童；②性別不限；③有IBD臨床表現(xiàn)，如慢性腹瀉、腹痛或便血，糞便鈣衛(wèi)蛋白≥200 μg·g-1[5, 6]，臨床疑診VEO-IBD，需要行WES檢測加以確診；④父母/監(jiān)護人了解本研究目的，簽署書面知情同意書。符合本文IL10RA基因功能缺失性突變者為IL10RA組，未檢測到突變者為癥狀組。

1.5 健康組納入標準 ①在我院職工家屬中招募健康兒童；②2周內(nèi)未服用益生菌及抗生素；③IL10RA組和癥狀組<1歲患兒按月齡行健康兒童匹配、>1歲患兒則按年齡進行匹配。

1.6 糞便標本采集IL10RA組和癥狀組于入院后第1次糞鈣衛(wèi)蛋白檢測時留取2份糞便標本，1份用于檢測腸道菌群組成及多樣性。留取過程使用無菌容器及取樣器，由專人取未接觸容器壁且位于中深部的糞便標本約250 mg，在12 h內(nèi)抽提DNA或轉(zhuǎn)移至-80℃保存直至DNA抽提。健康組用課題組統(tǒng)一發(fā)放的含保存液的采集管在家留取糞便標本，于5 d內(nèi)抽提DNA或轉(zhuǎn)移至-20℃保存直至DNA抽提。

1.7 腸道菌群檢測

1.7.1 細菌總DNA提取及質(zhì)檢 采用糞便DNA提取試劑盒 FastDNA?SPIN Kit for Soil(MP公司，美國)，按產(chǎn)品說明書操作。使用超微量分光光度計 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific公司，美國)檢測DNA濃度及純度，1%瓊脂糖膠電泳檢測DNA完整性。

1.7.2 PCR擴增 擴增區(qū)域為細菌16SrRNA基因 V3-V4區(qū)(上海生工生物工程股份有限公司，中國)，引物序列為338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 。PCR擴增體系為20 μL，擴增程序為：95℃ 預變性3 min，30個循環(huán)(95℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s, 72℃ 延伸30 s)，最后72℃延伸10 min (PCR儀：美國ABI公司GeneAmp?9700型)。

1.7.3 PCR產(chǎn)物定量與均一化 將同一個樣本及其2個復孔的PCR產(chǎn)物混合后行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(上海美吉生物技術(shù)有限公司)回收PCR產(chǎn)物。按照每個樣本的測序量要求，將提純的PCR擴增產(chǎn)物按相應比例混合，將不同樣本混在1個文庫中，使后續(xù)文庫的測序量達到上機要求(測序量與PCR總量之間具有一定的相關(guān)性)。每個樣本使用的引物都帶有1個barcode來區(qū)分樣本。

1.7.4 Miseq文庫構(gòu)建及Illumina測序 取1.7.3中的混合物所構(gòu)建的基因文庫，用MISEQ 測序儀(Illumina公司，美國)測序。

1.8 臨床資料采集 ①從病史中收集IL10RA組和癥狀組患兒入院時的年齡、性別、身高、體重、出生方式，胎齡(<37周為早產(chǎn))及取樣前1個月內(nèi)抗生素使用天數(shù)；②鑒于健康組來源于我院職工家屬中招募的健康兒童，身高、體重以2005年中國九市7歲以下兒童體格發(fā)育調(diào)查相應年齡的P75身高、體重值為標準[7]；③健康組詢問家長年齡、胎齡(<37周為早產(chǎn))和取樣前1個月內(nèi)抗生素使用情況。

1.9 統(tǒng)計學分析 計量資料，如服從正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示；不服從正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位間距)表示。服從正態(tài)分布且方差齊性的兩組計量資料比較采用t檢驗，3組計量資料比較采用單因素方差分析，等級資料的比較采用卡方檢驗。對于非正態(tài)分布的計量資料及計數(shù)資料的兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗，3組之間比較采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗，并采用Bonferroni進行兩兩比較校正。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

腸道菌群測序結(jié)果分析：①使用生物信息學分析軟件FLASH和Trimmomatic實現(xiàn)數(shù)據(jù)去雜；②按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析；③采用mothur軟件(v.1.30.1) 計算多樣性指數(shù)；④多級物種Sunburst圖、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和隨機森林樹分析均采用R語言工具統(tǒng)計和作圖；⑤線性判別分析采用LEfSe多級物種差異判別軟件。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2016年10月1日至2017年11月1日在我院符合本文IL10RA組和癥狀組納入標準的連續(xù)樣本分別為17例和15例，健康組22人。表1顯示3組的基線特征比較。身高及取樣前1個月內(nèi)抗生素平均使用天數(shù)在3組間差異有統(tǒng)計學意義。IL10RA組和癥狀組的年齡、性別、身高、體重、剖宮產(chǎn)率、早產(chǎn)率及取樣前1個月內(nèi)的抗生素平均使用天數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義。本研究未詢問健康組剖宮產(chǎn)信息。

2.2 菌群多樣性分析 圖1顯示，IL10RA組、癥狀組和健康組的平均Shannon多樣性指數(shù)值分別為1.11±0.87、1.43±0.55和1.86±0.53，IL10RA組及癥狀組均低于健康組，IL10RA組更為顯著；IL10RA組的標準差最大，提示IL10RA組患兒的組內(nèi)菌群變異度高；3組Simpson多樣性指數(shù)分別為0.48±0.31、0.32±0.20和0.19±0.11，與Shannon指數(shù)結(jié)果一致。

2.3 群落分類學結(jié)構(gòu)分析 表2顯示腸道細菌主要門分類學水平下的物種構(gòu)成，分析發(fā)現(xiàn)，菌屬在各組中的分布比例不同，如厚壁菌門是該年齡段嬰幼兒的優(yōu)勢菌門。健康組厚壁菌門分類學水平下的菌屬比例均衡，癥狀組和IL10RA組中鏈球菌屬和腸球菌屬的平均豐度之和分別占厚壁菌門的61.8%和63.8%。健康組的放線菌門中雙歧桿菌屬比例為97.8%；癥狀組放線菌門中的雙歧桿菌屬比例為53.8%，羅氏菌屬比例為31.7%；IL10RA組放線菌門則以羅氏菌屬為主，占64.3%。3組變形菌門主要由腸桿菌屬、埃希氏菌屬-志賀菌屬及克雷伯菌屬構(gòu)成，物種構(gòu)成比例較相似。3組擬桿菌門均以擬桿菌屬比例最高。其中，IL10RA組中另有普氏菌屬占33.3%。

2.4 屬分類學水平相對豐度比較 圖2顯示，有17種菌屬在IL10RA組和健康組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中雙歧桿菌屬、普拉梭菌屬、毛螺桿菌科_NC2004_group、Fusicatenibacter、腸球菌屬、[Eubacterium]_rectale_group、[Eubacterium]_ventriosum_group和毛螺桿菌科_UCG-004共8種菌在IL10RA組與健康組、癥狀組與健康組的兩兩比較中差異有統(tǒng)計學意義。除了腸球菌屬外，其余7種在IL10RA組及癥狀組中的豐度均降低。雙歧桿菌屬、普拉梭菌屬、unclassified_f_Peptostreptococcaceae和Fusicatenibacter4種菌屬的相對豐度經(jīng)Bonferroni校正后的差異仍有統(tǒng)計學意義(P<0.017)。僅在IL10RA組與健康組的比較中差異有統(tǒng)計學意義的9種菌屬也都以在IL10RA組中豐度降低為主。在癥狀組與健康組的比較中豐度差異有統(tǒng)計學意義的10個菌屬，除了鏈球菌屬及顆粒鏈菌屬外，其他8種菌屬的相對豐度在癥狀組中也均降低。

注 1)Kruskal-Wallis檢驗；2)Mann-Whitney U檢驗；3)卡方檢驗；4)單因素方差分析；5)t檢驗 ；P1為3組比較P值，P2為IL10RA組和癥狀組比較P值

圖1 3組腸道菌群多樣性指數(shù)比較

表2 3組門分類學水平下豐度占優(yōu)勢的菌屬(%)

圖2 組間比較中相對豐度差異有統(tǒng)計學意義的菌屬

注 圖中綠柱代表在IL10RA組和健康組比較中相對豐度差異有統(tǒng)計學意義的菌屬對應的P值取-log10數(shù)值；紅柱表示在癥狀組及健康組比較中相對豐度差異有統(tǒng)計學意義的菌屬對應的P值取-log10數(shù)值。圖中實線代表P<0.05時-log(0.0.5)=1.30; 虛線代表經(jīng)過Bonferroni校正后的差異仍有統(tǒng)計學意義P<0.017時-log(0.0167)=1.78

3 討論

本文基于16S rRNA基因測序方法采用橫斷面調(diào)查對IL10RA基因功能缺陷患兒腸道菌群組成進行分析。我院消化科在1年期間納入了IL10RA基因功能缺陷致VEO-IBD患兒17例和未檢測到基因功能缺陷的類似癥狀患兒15例的連續(xù)樣本，對于罕見病的橫斷面調(diào)查，一是樣本量較大，二是納入病例避免了選擇性偏倚。

隨著基因診斷技術(shù)的進展，臨床科研工作中對IL10RA基因突變導致的VEO-IBD的診斷、臨床特點及治療的認知已有所提高[1, 3, 4]。本研究分析了IL10RA基因功能缺陷患兒腸道菌群的分布及其水平。IL10RA組患兒的腸道菌群多樣性較健康組降低，且IL10RA組患兒的組內(nèi)菌群多樣性變異度更高。菌群變異度高可能與患兒的腸道菌群恢復力下降有關(guān)[8]。健康的腸道菌群受到外界環(huán)境干擾時，有一定的恢復力，能夠在一定范圍內(nèi)維持相對穩(wěn)定[8]。疾病狀態(tài)下，腸道菌群可能因抗生素暴露等外界原因?qū)е禄謴土κ軗p。而內(nèi)源性因素的干擾，例如IL10RA基因功能缺陷，則有可能使腸道菌群恢復力受損程度加劇，甚至失去恢復力，導致組內(nèi)變異度大[9]。

本研究中腸道菌群結(jié)構(gòu)分析表明，IL10RA組放線菌門、厚壁菌門及擬桿菌門分類學水平下的豐度比例最高的菌屬發(fā)生了改變。在IL10RA組中相對豐度比例高的菌屬包括羅氏菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬及普氏菌屬。其中，腸球菌是院內(nèi)感染的重要病原菌。普氏菌屬是引起感染的常見致病性厭氧菌。鏈球菌屬多數(shù)不致病，有些菌種如化膿性鏈球菌可引起化膿性炎癥。羅氏菌屬的胺胨羅斯氏菌屬于口腔及呼吸道的正常菌群，但在免疫缺陷患兒中仍被認為是機會性致病菌[10]。從這些菌屬的生物學特性可推測IL10RA組患兒的腸道菌群可能有潛在致病性。

Takaishi等[11]通過定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，IBD患者糞便菌群中的擬桿菌屬、雙歧桿菌屬及韋榮球菌屬豐度降低，乳桿菌屬及腸球菌屬相對豐度增加。Shaw等[12]觀察到新發(fā)IBD患者中的糞球菌屬、Adlercreutzia屬及柔嫩梭菌屬的豐度降低； 而Akkermansia屬、梭桿菌屬及韋榮球菌屬豐度增高。Gevers等[13]聯(lián)合16SrRNA基因檢測和宏基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)，克羅恩病患者的大腸桿菌、具核梭桿菌、小韋榮球菌及麻疹孿生球菌增加，而其他菌屬減少。本研究中IL10RA組中除腸球菌的豐度明顯增加，腸道菌群失衡表現(xiàn)為腸道共生菌的豐度減少。梭桿菌屬及孿生菌屬的相對豐度低或未檢測到。研究表明，具核梭桿菌在結(jié)腸癌患者的結(jié)腸組織中豐度高，并且該菌與化療耐藥有關(guān)。這些菌屬多在更年長人群的腸道中出現(xiàn)，可能因為腸道菌群存在時間上的演替變化[14, 15]。

本文局限性：①IL10RA組和癥狀組的患兒均經(jīng)過了不同程度的抗生素干預，本文所反映的腸道菌群不論是門還是屬水平，都不能代表IL10RA組和癥狀組患兒起病狀態(tài)的水平，盡管以癥狀組作為抗生素使用對照，但IL10RA組和癥狀組應用的抗生素種類、劑量和時間是有差別的；②本研究采用的是16SrRNA測序技術(shù)，對物種分類學水平僅注釋到屬水平。將來可采用宏基因組鳥槍法等更高分辨率的技術(shù)鑒定出更多物種，且可注釋到相應的菌株水平的物種，對于菌群特征的描述將更為全面。