楊 科 丁 宏 羅祥波 普仕華 郭兆衛(wèi) 侯明省 馮德正 張書(shū)光*

（1.德宏州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南芒市 678400;2.梁河縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南梁河 679200;3.隴川縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南隴川 678700）

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化方向發(fā)展，豬群常發(fā)生多病原混合感染、繼發(fā)感染，其中豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬藍(lán)耳病毒（PRRS）是較易混合感染的危害養(yǎng)豬業(yè)的四大病毒性疫病。近年來(lái)這四種病毒病溫和型不斷出現(xiàn)，通過(guò)臨床癥狀、病理解剖和藥物診斷往往無(wú)法做出準(zhǔn)確的診斷，常常需要借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能做出確診，而實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要組織處理、核酸提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)四大流程，四種病毒病檢測(cè)下來(lái)最快需要兩到三天甚至更久，使得養(yǎng)殖戶(hù)蒙受巨大損失，因此如何在不影響靈敏度和準(zhǔn)確度的前提下縮短檢測(cè)流程已迫在眉睫。我們獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)大量摸索，樣品處理、核酸提取流程均已優(yōu)化，可在半個(gè)小時(shí)內(nèi)提取到總核酸，在此基礎(chǔ)上建立起了一種單臺(tái)PCR、單次PCR擴(kuò)增、一次性檢測(cè)豬瘟、藍(lán)耳、圓環(huán)、偽狂犬病毒四種病原的方法。

1 材料與方法

1.1 陽(yáng)性病料和引物設(shè)計(jì)、合成

陽(yáng)性病料和豬瘟、藍(lán)耳、圓環(huán)、偽狂犬病毒檢測(cè)引物由云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。引物擴(kuò)增片段大小為350bp。

1.2 儀器設(shè)備、酶和試劑盒

核酸自動(dòng)提取儀NP968-S（西安天?。?，震動(dòng)球磨儀GT200（格瑞德曼），PCR儀（德國(guó)耶拿），Syngene凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP），Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒（西安天?。?，PrimeScript? One Step RT-PCR Kit（TAKARA）。

1.3 總RNA的提取

分別應(yīng)用西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒和從陽(yáng)性病料（脾、肺、淋巴結(jié)）中提取總DNA/RNA，具體操作過(guò)程見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.4 四種病毒快速診斷方法的建立

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的大量摸索，豬瘟、藍(lán)耳、圓環(huán)、偽狂犬引物的最佳退火溫度分別為54℃、50℃、55℃、58℃，利用梯度PCR的touchdown功能（在引物退火溫度摸索過(guò)程中，每一列的溫度都不相同，將四種引物的最高和最低TM值作為區(qū)間），將四種檢測(cè)不同病毒核酸的體系放置于一臺(tái)PCR中進(jìn)行擴(kuò)增，一次擴(kuò)增相當(dāng)于利用四臺(tái)PCR同時(shí)擴(kuò)增，大大縮減PCR所需時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取效果圖

使用核酸自動(dòng)提取儀提取法（磁珠法）提取陽(yáng)性病料中的總核酸，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)提取出了高質(zhì)量的RNA，符合本實(shí)驗(yàn)要求。

疫苗總RNA提取效果圖

2.2 四種病毒快速診斷方法的建立

3 討論

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化方向發(fā)展，豬群常發(fā)生多病原混合感染、繼發(fā)感染，其中豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬藍(lán)耳病毒（PRRS）是較易混合感染的危害養(yǎng)豬業(yè)的四大病毒性疫病。近年來(lái)這四種病毒病溫和型不斷出現(xiàn)，通過(guò)臨床癥狀、病理解剖和藥物診斷往往無(wú)法做出準(zhǔn)確的診斷，常常需要借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能做出確診，而實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要組織處理、核酸提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)四大流程，四種病毒病檢測(cè)下來(lái)最快需要兩到三天甚至更久，使得養(yǎng)殖戶(hù)蒙受巨大損失。因此，我們建立了一種可快速準(zhǔn)確一步法檢測(cè)四種豬病的RT-PCR 技術(shù)。

目前RT-PCR檢測(cè)豬病的技術(shù)主要環(huán)節(jié)為樣品處理、核酸提取和穩(wěn)定的檢測(cè)引物三個(gè)方面。本實(shí)驗(yàn)將四種豬病的檢測(cè)流程簡(jiǎn)化為一次PCR擴(kuò)增，本來(lái)需要三天才能完成的檢測(cè)一天完成，大大縮減養(yǎng)殖戶(hù)等待檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間，可以更好地為養(yǎng)殖戶(hù)提供診斷和治療建議。

試驗(yàn)結(jié)果表明，一步法檢測(cè)四種豬病的RT-PCR 技術(shù)和單獨(dú)擴(kuò)增方法并無(wú)區(qū)別，只是利用PCR儀的touchdown功能，將本該四次PCR擴(kuò)增的步驟簡(jiǎn)化為一步完成，大大縮減檢測(cè)時(shí)間，提高了監(jiān)測(cè)效率，可以廣泛推廣使用。