姚佳沛，劉煒，徐建春，李顥

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明 650031)

全球范圍內(nèi)膀胱癌的發(fā)病率位居惡性腫瘤的第9位，膀胱尿路上皮癌(BUC)是最常見的類型[1]。BUC依照是否發(fā)生肌層浸潤可分為浸潤性尿路上皮細(xì)胞癌與非浸潤性尿路上皮細(xì)胞癌。BUC組織學(xué)形態(tài)多樣，臨床上已見多種變異型，形態(tài)學(xué)上可近似良性病變，為病理醫(yī)生的鑒別診斷增加了難度；同時(shí)有些變異型BUC侵襲性較普通型更高，更需要加強(qiáng)監(jiān)測謹(jǐn)慎制定治療方案[2]。近年來，盡管以外科手術(shù)為代表的腫瘤治療手段飛速發(fā)展，但BUC患者

的預(yù)后并沒有得到顯著的改善，患者術(shù)后5年生存率在50%～60%[3]。新的診療手段，例如BUC特異性腫瘤標(biāo)記物，可能是未來發(fā)展的方向。樁蛋白作為一種分布廣泛的信號蛋白，是近年學(xué)者們研究的熱點(diǎn)之一。樁蛋白家族包括樁蛋白、過氧化氫誘導(dǎo)的克隆5與Leupaxin[4]。樁蛋白在體內(nèi)的作用范圍最為廣泛，其能夠激活局部黏著斑激酶(FAK)信號通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移[5]，因此推測樁蛋白可能與腫瘤的形成與發(fā)展有關(guān)。近年來的研究[6～8]表明，樁蛋白與多種腫瘤密切相關(guān)，但樁蛋白在BUC的起病與發(fā)展過程中的作用目前尚不明確。本研究觀察了BUC組織中樁蛋白的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年9月～2015年12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的BUC患者93例，男71例，女22例；年齡51～73(59±8.17)歲，其中≤60歲34例、>60歲59例；腫瘤直徑(3.41±2.17)cm，其中≤3 cm 27例，>3 cm 66例；組織低分化42例，高分化51例；臨床分期T1～T2期44例，T3～T4期49例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病歷資料完整，所有患者均知情同意；②術(shù)后經(jīng)病理科確診為BUC；③為原發(fā)性BUC，且未合并其他惡性腫瘤；④術(shù)前未經(jīng)放、化療及其他輔助抗腫瘤手段治療；⑤未合并其他嚴(yán)重代謝性疾病；⑥完成隨訪調(diào)查。手術(shù)留取BUC組織93例份(觀察組)，另取37例份正常膀胱組織作為對照(對照組)。

1.2 樁蛋白檢測方法 采用免疫組化法。將保存的石蠟包埋標(biāo)本以間距4 μm連續(xù)切片，烤箱中65 ℃烤片過夜，常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸緩沖液中煮沸(95 ℃)修復(fù)，自然冷卻后以TBS洗滌2次，以正常山羊血清封閉，孵育30 min，加入一抗樁蛋白單克隆抗體(CST，購于上海北諾生物科技有限公司)，陰性對照采用PBS代替，于4 ℃孵育過夜。TBS洗滌3次，加入二抗EnVisionTM+/HRP(DAKO，購于上海北諾生物科技有限公司)37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染。常規(guī)制片。結(jié)果判定：300倍光學(xué)高倍鏡下取4個(gè)不同視野，每個(gè)視野至少含有100個(gè)細(xì)胞，4視野的計(jì)分結(jié)果取算術(shù)平均數(shù)。將染色結(jié)果計(jì)分分為染色程度計(jì)分與染色數(shù)目計(jì)分，染色程度計(jì)分：無染色計(jì)0分，淺黃至黃色計(jì)1分，黃棕色計(jì)2分，褐色計(jì)3分；染色數(shù)目計(jì)分：<5%計(jì)0分，5～25%計(jì)1分，25%～75%計(jì)2分，>75%計(jì)3分；程度計(jì)分×數(shù)目計(jì)分得到染色結(jié)果總分，其中0～3分視為陰性表達(dá)，>3分視為陽性表達(dá)。

1.3 隨訪方法 以患者術(shù)后出院為觀察起點(diǎn)，利用電話、電子通訊等手段并結(jié)合患者復(fù)診記錄進(jìn)行隨訪調(diào)查，隨訪9～62(39.14±8.62)個(gè)月。失訪病例已剔除。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，利用Kaplan-Meier生存曲線分析患者生存率與生存時(shí)間。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組樁蛋白表達(dá)比較 觀察組及對照組樁蛋白陽性率分別為50.54%(47/93)、0，兩組比較，P<0.05。

2.2 樁蛋白表達(dá)與BUC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見表1。由表1可知，樁蛋白表達(dá)與BUC組織分化程度、臨床分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P均<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤直徑無相關(guān)性(P均>0.05)。

表1 樁蛋白表達(dá)與BUC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 樁蛋白表達(dá)與BUC患者預(yù)后的關(guān)系 觀察組患者按照樁蛋白表達(dá)結(jié)果分為樁蛋白陽性表達(dá)者(47例)與樁蛋白陰性表達(dá)者(46例)，隨訪調(diào)查結(jié)果制成Kaplan-Meier生存曲線(圖1)。樁蛋白陽性表達(dá)者生存率為59.57%(28/47)、生存時(shí)間(43.99±2.57)個(gè)月，樁蛋白陰性表達(dá)者生存率為84.78%(39/46)、生存時(shí)間(54.41±2.24)個(gè)月，兩組比較，P均<0.05。

圖1 樁蛋白陽性、陰性表達(dá)者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

BUC多起源于上皮細(xì)胞，發(fā)病初期癥狀不明顯，多為血尿，但可自行減輕或停止，較為隱匿，但惡性程高。在我國，BUC的發(fā)病率位居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之首，也是引發(fā)癌癥相關(guān)死亡的主要病因之一[9]。BUC存在多種生物學(xué)行為，臨床上公認(rèn)的治療難點(diǎn)在于復(fù)發(fā)容易，預(yù)后診斷難[10]。依據(jù)BUC的不同細(xì)胞生物學(xué)行為，一般將其分為兩種，非肌層浸潤性BUC即表淺性、高分化腫瘤，約占BUC的80%左右，治療相對容易，但也易復(fù)發(fā)；肌層浸潤性BUC即浸潤性、低分化腫瘤，惡性程度較高，一般需要聯(lián)合治療。傳統(tǒng)BUC的治療方案以外科手術(shù)切除和放化療為主，但即使聯(lián)合應(yīng)用藥物膀胱內(nèi)灌注治療、光動(dòng)力治療等輔助抗腫瘤手段，仍無法明顯降低BUC復(fù)發(fā)率與病死率，同時(shí)聯(lián)合方案的不良反應(yīng)也較大，給患者帶來生理、經(jīng)濟(jì)上的多重壓力[11,12]。近年來，隨著臨床技術(shù)的發(fā)展，非肌層浸潤性BUC患者能夠選擇膀胱內(nèi)卡介苗作為主要的免疫治療手段[13]；而根治性膀胱切除術(shù)為代表的外科手術(shù)仍然是治療肌層浸潤性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)方案，同時(shí)該手術(shù)對非肌層浸潤性BUC也有一定的療效[14]。合理選擇治療方案一直是影響患者預(yù)后與生活質(zhì)量的關(guān)鍵因素。臨床上一般依據(jù)臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等傳統(tǒng)腫瘤相關(guān)病理參數(shù)估計(jì)[15]。然而，許多臨床病理參數(shù)相似的患者術(shù)后生存時(shí)間差異巨大[16]，說明目前的臨床病理參數(shù)并不能準(zhǔn)確反映患者的情況。盡管近年來BUC的診斷方面有許多進(jìn)展，例如以熒光原位雜交探針為代表的免疫組化相關(guān)病理診斷手段，臨床上已較多地應(yīng)用于尿液細(xì)胞樣本篩查和復(fù)發(fā)監(jiān)測[17]，但BUC患者的預(yù)后卻并沒有得到明顯的改善。因此，深入研究BUC的發(fā)生與惡性進(jìn)展機(jī)制，從而指定針對性的診療方案成為改善臨床診療方案的當(dāng)務(wù)之急。

樁蛋白是一種多功能的多結(jié)構(gòu)域蛋白，分子量約68 kD，于SRC基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中最先被發(fā)現(xiàn)，是一種能與癌基因結(jié)合的細(xì)胞連接相關(guān)蛋白[18]。樁蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞黏著斑，在平滑肌組織中表達(dá)最高，能夠通過與結(jié)構(gòu)分子、信號分子的連接參與調(diào)控細(xì)胞黏著斑的結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞的黏附與遷移[19]。正常表達(dá)的樁蛋白是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞黏附、分化、繁殖等生理活動(dòng)的必須，但樁蛋白的異常表達(dá)會引起細(xì)胞形態(tài)的改變，引發(fā)細(xì)胞黏附能力異常，從而引發(fā)多種疾病[20]。腫瘤的原位侵襲、遠(yuǎn)端浸潤與腫瘤細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)，而細(xì)胞的遷移能力是一個(gè)由前黏著斑消失伴隨新黏著斑形成的動(dòng)態(tài)過程，與細(xì)胞的黏附力直接相關(guān)[21]，因此可以推測黏著斑相關(guān)的樁蛋白表達(dá)必然影響腫瘤細(xì)胞的侵襲力。近期研究[22]顯示，由樁蛋白、肉瘤基因(Src)、FAK參與調(diào)控的絡(luò)氨酸磷酸化作用是細(xì)胞非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。而許多細(xì)胞因子正是通過Tyr31/118磷酸化樁蛋白，從而促進(jìn)或調(diào)控腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移[23～25]。因此，樁蛋白具有成為抗腫瘤治療新靶點(diǎn)的可能。Zheng等[26]認(rèn)為，樁蛋白在前列腺癌組織中較正常組織高表達(dá)，其表達(dá)與前列腺癌病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)樁蛋白表達(dá)較高的患者預(yù)后較差。另文獻(xiàn)[27～29]報(bào)道，樁蛋白在胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中的表達(dá)也呈現(xiàn)出類似的作用。因此，初步推測樁蛋白在腫瘤組織中的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、惡性進(jìn)展密切相關(guān)。

本研究顯示，樁蛋白在正常膀胱組織中未見陽性表達(dá)，而在BUC組織中陽性率為50.54%，提示樁蛋白在BUC組織中的表達(dá)異常上調(diào)，與前述其他類型腫瘤組織中同樣顯著升高的效果相似，因此樁蛋白的異?？赡芘cBUC的形成相關(guān)。本研究還顯示，樁蛋白表達(dá)與BUC臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此可以推測，樁蛋白在BUC腫瘤細(xì)胞中，應(yīng)當(dāng)呈現(xiàn)出與其他類型腫瘤細(xì)胞中類似的作用，即促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力，樁蛋白可能有潛力成為臨床上反應(yīng)BUC患者腫瘤惡性程度的生物標(biāo)記物之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，樁蛋白陽性表達(dá)者的預(yù)后顯著差于樁蛋白陰性表達(dá)者，提示樁蛋白可以作為BUC患者不良預(yù)后的生物標(biāo)記物。因此，針對樁蛋白表達(dá)陽性患者，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)護(hù)，重視復(fù)診，重點(diǎn)防范BUC的術(shù)后復(fù)發(fā)，以盡可能改善患者預(yù)后。

總之，BUC組織中樁蛋白表達(dá)升高，其可能參與BUC的發(fā)生發(fā)展。