黃云芬 許慶芳 黎鈺瑩 許新雅 謝陽 夏悅 萬苗堅(jiān) 陸春 賴維

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）是蛋白質(zhì)、脂類、核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖通過非酶糖化反應(yīng)生成不可逆及不易降解的大分子棕色產(chǎn)物［1］。AGE影響人體蛋白質(zhì)、脂類、核酸等物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，是衰老相關(guān)疾病的重要病理特征。新近發(fā)現(xiàn)AGE在光老化皮膚中堆積，在光老化中起重要作用［2］。組織蛋白酶D（cathepsin D，CatD）是降解AGE的重要蛋白酶之一［3］，但它是否在光老化皮膚AGE降解及堆積中起作用，目前還不清楚。本研究采用免疫組化和免疫熒光雙染法，檢測并比較CatD和AGE在不同年齡組曝光和非曝光部位皮膚中的表達(dá)，并對它們之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，初步探討CatD在光老化皮膚AGE降解及堆積中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.皮膚組織標(biāo)本來源：皮膚組織標(biāo)本均來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科病理活檢術(shù)及皮膚外科手術(shù)切除的皮膚組織，患者均未患糖尿病。如為非腫瘤良性病變，則切取皮損周邊正常皮膚；如為可疑惡性腫瘤手術(shù)，先經(jīng)術(shù)中冰凍切片檢查確認(rèn)腫瘤邊界后，再切取周邊未受累正常皮膚。本研究經(jīng)過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（［2017］2-11），所有提供標(biāo)本的患者均簽署知情同意書。

2.試劑和儀器：一抗兔抗人CatD-IgG抗體、鼠抗人AGE-IgG抗體（美國Abcam公司），驢抗鼠二抗和羊抗兔二抗、Hoechst33342染料（美國Life Technology公司）。

二、方法

1.免疫組化染色檢測CatD和AGE在各年齡段曝光和非曝光部位皮膚組織中的表達(dá)：受試者分為15～20歲、35～40歲、55～60歲、75～80歲4個(gè)年齡段，每年齡段又分為非曝光組和曝光組，共8組，每組6份標(biāo)本。曝光部位主要取自患者的面部及前臂皮膚，非曝光部位取自胸背部、臀部、大腿等處皮膚。取4%多聚甲醛固定、石蠟包埋的組織塊，切片，常規(guī)脫蠟至水。乙二胺四乙酸（EDTA）緩沖液熱修復(fù)，以含0.1%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次。5%脫脂奶粉封閉30 min后加入50 μl兔抗人CatD IgG抗體、鼠抗人AGE IgG抗體（1∶200稀釋）一抗，4℃孵育過夜。PBS漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗鼠IgG和山羊抗兔IgG抗體孵育1 h。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色1～3 min，清水漂洗。蘇木素復(fù)染1 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。圖像采集系統(tǒng)400倍下連續(xù)拍照，以Image-Pro Plus 6.0圖像系統(tǒng)分析，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400），測定陽性區(qū)域圖像的積分吸光度（IOD）值。平均吸光度值=IOD值/面積。

2.免疫熒光雙染法檢測CatD和AGE在各年齡組曝光和非曝光皮膚組織中的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分組同上，每組6份標(biāo)本。取液氮保存的皮膚組織，冰凍切片至5 μm，冷丙酮固定10 min，PBS漂洗3次。以5%脫脂奶粉封閉30 min后，加入50 μl（1∶200稀釋）兔抗人CatD一抗，4℃孵育16 h，室溫復(fù)溫，PBS漂洗。再加入50 μl（1∶200稀釋）鼠抗人AGE一抗，4℃孵育16 h，室溫復(fù)溫，PBS漂洗。然后同時(shí)加入1∶1 000稀釋的兩種熒光二抗，于37℃孵育1 h。PBS漂洗后，用1∶2 000稀釋的Hoechst 33342染核2 min。所有照片均在暗室用熒光顯微鏡（×200）拍攝。用Image-Pro Plus 6.0圖像系統(tǒng)分析陽性表達(dá)的面積比值，陽性面積＜0.1%示陰性（-），0.1%～＜1%示弱陽性（+），1%～＜10%示陽性（++），≥ 10%示強(qiáng)陽性（+++）。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用雙因素方差分析，若兩因素?zé)o交互作用，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析；若兩因素有交互作用，則采用析因設(shè)計(jì)方差分析。等級資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。AGE堆積與CatD表達(dá)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、免疫組織化學(xué)染色檢測CatD和AGE在各年齡段曝光和非曝光皮膚組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析

免疫組化結(jié)果顯示，加入CatD抗體后，真皮成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和毛囊皮脂腺細(xì)胞胞質(zhì)被染成黃褐色。AGE主要表達(dá)于真皮成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等細(xì)胞胞質(zhì)及真皮基質(zhì)的膠原纖維和彈性纖維。非曝光組CatD較同年齡曝光組染色深，且隨著年齡增加，CatD染色逐漸由深褐色變成淺褐色，胞質(zhì)內(nèi)CatD的表達(dá)逐漸減少。曝光組AGE染色較非曝光組染色深，分布范圍更廣，且隨著年齡增長，AGE染色逐漸加深。見圖1。

各組皮膚組織中CatD的平均吸光度值見表1。析因方差分析顯示，曝光對CatD表達(dá)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.70，P＜0.001），曝光組的CatD表達(dá)水平低于非曝光組。年齡對CatD表達(dá)的影響亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79.49，P＜0.001），且CatD表達(dá)水平隨著年齡的增長而降低。曝光與年齡對CatD的表達(dá)有交互作用（F=6.08，P=0.002）。進(jìn)一步分析單獨(dú)效應(yīng)，在固定年齡因素各水平條件下，除了15～20歲年齡組，其他年齡組對應(yīng)的曝光組和非曝光組間CatD表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），在固定曝光因素各水平條件下，不同年齡組間差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

析因方差分析顯示，曝光對AGE表達(dá)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=158.18，P＜0.001），曝光組AGE的表達(dá)水平高于非曝光組（表2）。年齡對AGE表達(dá)的影響亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=106.06，P＜ 0.001），且AGE表達(dá)水平隨著年齡的增長而升高。曝光與年齡對AGE的表達(dá)有交互作用（F=24.50，P＜0.001）。進(jìn)一步分析單獨(dú)效應(yīng)，除了15～20歲年齡組，其他各年齡段曝光組與非曝光組間AGE表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。在固定曝光因素各水平條件下，不同年齡組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

Pearson相關(guān)系數(shù)及簡單線性回歸分析顯示，曝光皮膚中AGE和CatD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，r=-0.915，P＜0.05，簡單線性回歸方程為Y=-2.501X+0.088；非曝光皮膚中為兩者亦呈負(fù)相關(guān)，r=-0.730，P＜0.05，簡單線性回歸方程為Y=-0.989X+0.044。上述方程中X為CatD、Y為AGE的平均吸光度值。

二、免疫熒光雙染法檢測CatD和AGE在各年齡段曝光和非曝光皮膚組織中表達(dá)差異

結(jié)果見表3和圖2。與免疫組化相比，免疫熒光雙染法更清晰地顯示CatD主要在真皮表達(dá)，AGE也主要在真皮堆積，兩者的位置有很好的一致性。

Wilcoxon秩和檢驗(yàn)顯示，曝光組與非曝光組CatD熒光表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.469，P=0.014），且非曝光組CatD熒光表達(dá)強(qiáng)度高于曝光組。Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)顯示，不同年齡組CatD熒光表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=29.25，P＜0.001），隨著年齡增長，其表達(dá)強(qiáng)度減弱。

Wilcoxon秩和檢驗(yàn)顯示，曝光組與非曝光組AGE熒光表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.017，P=0.003），非曝光組AGE熒光表達(dá)強(qiáng)度低于曝光組。Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)顯示，不同年齡組AGE熒光表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=12.83，P=0.005），隨年齡增長，其表達(dá)強(qiáng)度增加。

討 論

既往認(rèn)為AGE性質(zhì)穩(wěn)定，但最近研究發(fā)現(xiàn)，AGE可以降解，其降解途徑是通過被巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等胞吞后被泛素蛋白酶體或溶酶體蛋白酶降解，而CatD在其中起重要作用［3］。CatD屬于天冬氨酸蛋白酶，是溶酶體內(nèi)含量最豐富（濃度高達(dá)1 mmol/L）的蛋白酶，組織蛋白酶B和L酶原轉(zhuǎn)化為活性酶均有賴于CatD催化［4］。CatD還含有很強(qiáng)降解變性蛋白的肽鏈內(nèi)切酶，與公認(rèn)能降解AGE的胃蛋白酶有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)，且AGE在溶酶體酸性環(huán)境中變性后更易與蛋白水解酶的肽鍵結(jié)合被降解［3］。更重要的是，CatD可直接參與并調(diào)控細(xì)胞自噬，進(jìn)而調(diào)控AGE在溶酶體內(nèi)的降解［5］。Stolzing等［6］用AGE連接牛血清白蛋白（AGE-BSA）孵育體外培養(yǎng)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AGE-BSA能被胞吞，然后被胞內(nèi)20S蛋白酶體和溶酶體酶降解。但Bulteau等［7］發(fā)現(xiàn)，AGE主要結(jié)構(gòu)之一N-羥甲基賴氨酸可抵抗20S蛋白酶體降解。Grimm等［3］采用純化CatD、B以及20S蛋白酶體等分別孵育AGE，發(fā)現(xiàn)20S蛋白酶體完全不能降解AGE，CatD、B能降解AGE，其中CatD降解活性顯著高于CatB。隨后，他們又研究鼠胚胎成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系RAW264.7對胞外AGE的降解，發(fā)現(xiàn)CatD在降解吞入胞內(nèi)的AGE中起重要作用［8］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，光老化皮膚和皮膚成纖維細(xì)胞中CatD表達(dá)均降低［9］，但CatD表達(dá)降低是否與光老化皮膚AGE堆積相關(guān)還不清楚。

圖1 免疫組化染色檢測組織蛋白酶D（CatD）和晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）在各年齡段曝光和非曝光皮膚組織中的表達(dá)（×200） 各曝光組CatD的表達(dá)均隨年齡增加而顯著下降，而AGE的沉積則隨年齡增加而顯著增多；曝光組CatD的表達(dá)均較同年齡非曝光組顯著降低，而曝光組AGE沉積均比同年齡非曝光組顯著升高

表1 各年齡段曝光和非曝光部位皮膚組織中組織蛋白酶D的平均吸光度值（±s）析因方差分析結(jié)果

表1 各年齡段曝光和非曝光部位皮膚組織中組織蛋白酶D的平均吸光度值（±s）析因方差分析結(jié)果

注：n=6。a主效應(yīng)；b交互效應(yīng)

組別非曝光組曝光組合計(jì)F值P值15～20歲0.032±0.007 0.032±0.004 0.032±0.005 0.041 0.841 35～40歲0.032±0.005 0.020±0.005 0.026±0.008 22.132＜0.001 55～60歲0.026±0.002 0.012±0.004 0.019±0.008 32.633＜0.001 75～80歲0.013±0.004 0.002±0.001 0.007±0.007 22.132＜0.001合計(jì)0.026±0.009 0.016±0.012-58.699a＜0.001a F值25.422 53.149 79.492a 6.079b P值＜0.001＜0.001＜0.001a 0.002b

表2 各年齡段曝光和非曝光部位皮膚組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物的平均吸光度值（±s）析因方差分析結(jié)果

表2 各年齡段曝光和非曝光部位皮膚組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物的平均吸光度值（±s）析因方差分析結(jié)果

注：n=6。a主效應(yīng)；b交互效應(yīng)

15～20歲0.006±0.001 0.007±0.003 0.007±0.002 0.044 0.835 35～40歲0.010±0.003 0.030±0.008 0.020±0.012 18.820＜0.001 55～60歲0.021±0.004 0.066±0.010 0.044±0.025 95.982＜0.001 75～80歲0.035±0.009 0.085±0.015 0.060±0.029 116.841＜0.001合計(jì)0.018±0.012 0.047±0.032-158.184a＜0.001a F值15.581 114.983 106.063a 24.501b P值＜0.001＜0.001＜0.001a＜0.001b

表3 免疫熒光雙染法檢測晚期糖基化終末產(chǎn)物和組織蛋白酶D在各年齡段曝光和非曝光皮膚組織中的表達(dá)（例）

圖2 免疫熒光雙染檢測晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）和組織蛋白酶D（CatD）在各年齡段曝光和非曝光皮膚組織中的表達(dá)（×200） 綠色熒光示CatD陽性表達(dá)，紅色熒光示AGE陽性表達(dá)，Hoechst將細(xì)胞核染成藍(lán)色，“重疊”為以上3種熒光的融合

我們發(fā)現(xiàn)CatD和AGE在不同年齡段曝光和非曝光部位皮膚表皮、真皮中都有表達(dá)。AGE主要累及更新率緩慢、富含賴氨酸的蛋白質(zhì)。人皮膚膠原蛋白、彈性蛋白代謝緩慢，并含較多賴氨酸及羥賴氨酸，它們是皮膚發(fā)生糖化反應(yīng)的主要蛋白［10］。本研究也證實(shí)，隨年齡增長，曝光和非曝光皮膚中增多的AGE主要沉積于真皮。AGE在機(jī)體生成要經(jīng)歷漫長的非酶糖化反應(yīng)過程，但ROS和高血糖可促進(jìn)AGE生成［11］。ROS在紫外線照射皮膚組織中顯著升高［12］，因此紫外線加速了皮膚AGE生成。本研究也發(fā)現(xiàn)，曝光組AGE沉積顯著高于同年齡非曝光組，推測光老化很可能也抑制了AGE降解。本研究還發(fā)現(xiàn)，在＞35歲各年齡段中，曝光組皮膚CatD表達(dá)均顯著低于同年齡段非曝光組，且在曝光各組皮膚中CatD和AGE表達(dá)分別隨年齡增長依次遞減和遞增，提示皮膚CatD和AGE表達(dá)與光老化程度密切相關(guān)。相關(guān)性分析顯示，AGE和CatD在曝光皮膚中的表達(dá)呈高度負(fù)相關(guān)，而在非曝光皮膚中呈中度負(fù)相關(guān)，表明慢性紫外線照射很可能通過抑制皮膚CatD表達(dá)阻礙AGE降解，提示可通過調(diào)控CatD表達(dá)來干預(yù)AGE堆積，從而改善光老化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，外用含0.001%CatD的凝膠于光老化皮膚2周，可顯著上調(diào)光老化皮膚CatD含量和改善光老化皮膚外觀［13］，其機(jī)制是否與外用CatD凝膠促進(jìn)光老化皮膚AGE降解有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

成纖維細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)新陳代謝中起重要作用。已有研究揭示，皮膚成纖維細(xì)胞膜高表達(dá)AGE受體［14］，意味著成纖維細(xì)胞可通過AGE受體胞吞胞外AGE，而胞內(nèi)CatD對光老化皮膚AGE降解起重要作用。我們采用實(shí)時(shí)RT-PCR和Western印跡法檢測并對比CatD在光老化和非光老化皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，證明光老化皮膚成纖維細(xì)胞中CatD mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低［9］。光老化皮膚成纖維細(xì)胞是否對吞入胞內(nèi)的AGE降解減少、有無其他蛋白酶在皮膚成纖維細(xì)胞降解胞內(nèi)AGE中起作用等還有待深入研究。