杜 杰

(山西大學(xué)體育學(xué)院,山西太原 030006)

近年來,隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高,高脂肪食物越來越多地出現(xiàn)在人們的餐桌上,造成人體脂肪攝入過量。大量研究表明,高脂肪飲食可誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)高血脂癥狀,而血脂紊亂是高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病發(fā)生的重要誘因[1-2]。不僅如此,血液中脂質(zhì)物質(zhì)含量升高也會導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂,過量的脂肪積累在肝臟中引起肝臟組織變性,如不加以控制會進(jìn)一步發(fā)展成肝臟疾病[3-4]。因此,調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝平衡具有十分重要的意義。

國際上推薦預(yù)防脂質(zhì)代謝紊亂及相關(guān)疾病的方法為生活方式的改變(如飲食習(xí)慣,作息習(xí)慣,規(guī)律運(yùn)動等)[4,18],其中,中強(qiáng)度有氧運(yùn)動是公認(rèn)的調(diào)節(jié)脂代謝紊亂的有效手段之一[10]。然而人們往往苦于找不到合適的食物以及運(yùn)動方案,從而達(dá)不到預(yù)期效果;或是一味地注重飲食忽略運(yùn)動的重要性,形成多坐少動的生活方式。翅果油是翅果油樹種仁經(jīng)過加工制成的淡黃色透明油狀液體,為第四紀(jì)冰川作用后殘遺下來的資源,富含不飽和脂肪酸、維生素E及植物甾醇等營養(yǎng)成分[5],具有降血脂、抗氧化、預(yù)防心血管疾病等功效[7-9],已經(jīng)被我國批準(zhǔn)為新資源食品[6]。目前有關(guān)膳食翅果油聯(lián)合中強(qiáng)度有氧運(yùn)動改善高脂飲食引發(fā)的脂代謝紊亂及脂質(zhì)積累方面的研究還未見報道。

本實(shí)驗(yàn)對C57BL/6小鼠給以高脂飲食誘導(dǎo)血脂升高及肝臟脂肪變性,考察翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動對高脂飲食誘導(dǎo)的血脂代謝紊亂和肝臟脂肪積累的改善作用,為飲食與運(yùn)動相結(jié)合改善高脂飲食誘發(fā)的相關(guān)疾病的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

翅果油 超臨界二氧化碳萃取所得,山西琪爾康翅果生物制品有限公司;雄性C57BL/6小鼠 SPF級,40只,4周齡,平均體重為(15.32+1.58) g,南京君科生物工程有限公司(許可證號為 SCXK(蘇)2016-0010)。小鼠分籠飼養(yǎng),給以12 h光照,12 h黑暗,室內(nèi)溫度為20～26 ℃,濕度為40%～60%;普通動物飼料 山西省醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心;動物45% kcal高脂飼料(配方:酪蛋白23.30%,胱氨0.35%,玉米淀粉8.50%,麥芽糊精11.65%,蔗糖20.14%,纖維素5.83%,豆油2.91%,豬油20.68%,復(fù)合礦物質(zhì)1.17%,磷酸氫鈣1.51%,碳酸鈣0.64%,檸檬酸鉀1.92%,復(fù)合維生素1.17%酒石酸氫膽堿0.23%) 北京科澳協(xié)力飼料有限公司;總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(LDL-C)酶學(xué)試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

ZS-PT型動物實(shí)驗(yàn)跑臺 北京眾實(shí)迪;KDC-140HR型高速冷凍離心機(jī) 中科中佳科學(xué)儀器有限公司;DW-86L959型超低溫冰箱 海爾生物醫(yī)療;Spectra Max190型酶標(biāo)儀 美國分子儀器;JXFSTPRP-I-02型組織勻漿儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;Leica Rm2235型組織切片機(jī) 德國萊卡;BME500型生物顯微鏡 歐普林光電設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)及分組 小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常對照組(NC)、高脂飲食組(HF)、高脂飲食+翅果油灌胃組(HS)、高脂飲食+有氧運(yùn)動組(HE)、高脂飲食+翅果油+有氧運(yùn)動組(SE),每組8只,共喂養(yǎng)8周。正常組飼喂普通飼料,高脂飲食組飼喂高脂飼料,HS組在飼喂高脂飼料的同時每天早8點(diǎn)灌胃0.5 mg/g體重的翅果油,HE組在飼喂高脂飼料的同時每天上午10:00進(jìn)行60 min中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(按照Fernando等[11]方案,以10 m/min適應(yīng)性跑步1周后,以12 m/min恒速跑步60 min),SE組在飼喂高脂飼料的同時每天灌胃翅果油及進(jìn)行有氧運(yùn)動。喂養(yǎng)期間,小鼠自由飲水,每3 d更換一次墊料,每周稱一次體重。

1.2.2 取材 小鼠喂養(yǎng)結(jié)束,禁食不禁水12 h,采用2%戊巴比妥鈉溶液麻醉,摘眼球取血,于3500 r/min,4 ℃離心20 min,分離血清,轉(zhuǎn)移到EP管中置于-20 ℃保存?zhèn)溆?小心摘取動物肝臟,用生理鹽水清洗,吸水紙吸取表面水分后稱重,并將動物肝臟一分為二,一部分迅速置于液氮中冷凍,用于檢測肝臟中TC、TG含量,一部分置于10%甲醛溶液中固定,用于肝組織形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 血清指標(biāo)檢測 小鼠血清脂質(zhì)指標(biāo)TC、TG、LDL-C和HDL-C含量按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的操作進(jìn)行檢測,并按照以下公式計算動脈粥樣硬化指數(shù)(AI)。

其中,CTC為血清TC濃度,mmol/L;CHDL-C為血清HDL-C濃度,mmol/L。

1.2.4 肝組織指標(biāo)檢測 取0.1 g冷凍肝臟,切碎,于勻漿機(jī)中低溫勻漿,3500 r/min,4 ℃離心20 min,收集上清液,按照酶學(xué)試劑盒說明書測定肝臟組織TC和TG含量。

1.2.5 肝臟組織形態(tài)學(xué)檢測 取一小塊固定好的肝臟組織,按照以下步驟進(jìn)行蘇木精和伊紅(H&E)染色。

脫水透明:肝臟組織分別置于不同濃度的酒精溶液中進(jìn)行梯度脫水,再采用二甲苯透明處理45 min兩次;

包埋修快:透明處理的肝組織置于包埋盒中進(jìn)行石蠟包埋,凝固后修塊;

制片:將修好的組織蠟塊置于組織切片機(jī)上切成6 μm的薄片,38 ℃水浴鍋中展開,貼于粘附載玻片上50 ℃烘干;

脫蠟:將制好的片依次在二甲苯中脫蠟20 min,梯度酒精浸泡5 min,蒸餾水浸泡5 min;

染色封片:蘇木精染色7 min,伊紅染色30 s,0.01%鹽酸酒精分色30 s,45 ℃水浴反藍(lán) 5 min,二甲苯浸泡兩次,每次5 min,中性樹脂封片；

組織觀察:將制好的切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理形態(tài)并拍照。根據(jù)Kleiner等[12]方法對肝臟脂肪變性進(jìn)行評分，肝臟脂肪變性評分如下:肝臟脂肪變性程度<5%,計0分;5%≤肝臟脂肪變性程度在≤33%,計1分;34%≤肝臟脂肪變性程度在≤66%,計2分;肝臟脂肪變性程度>66%,計3分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動對高脂飲食小鼠體重的影響

各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間體重的變化情況如圖1所,由結(jié)果可以看出,各組小鼠起始體重不具有顯著性差異(p>0.05)。經(jīng)過8周的喂養(yǎng),HF組小鼠體重顯著高于NC組(p<0.05);當(dāng)實(shí)驗(yàn)小鼠給予翅果油干預(yù)后,相比高脂飲食組(HF),HS組小鼠體重顯著降低10.64%(p<0.05),但仍與NC組體重具有顯著性的差異(p<0.05);經(jīng)過有氧運(yùn)動和翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動的干預(yù)后,與HF組相比,HE和SE組小鼠體重分別降低18.73%和16.10%(p<0.05),基本達(dá)到正常喂養(yǎng)水平。

圖1 小鼠體重增長曲線Fig.1 Body weight gain curve of mice

2.2 翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動對高脂飲食小鼠血清脂質(zhì)指標(biāo)的影響

各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間血清TG、TC、LDL-C和HDL-C的變化如圖2所示,由結(jié)果可以看出,經(jīng)過8周的喂養(yǎng),相比NC組,高脂飲食組小鼠的血清TG、TC、LDL-C分別顯著升高了68.47%、92.89%、332%(p<0.05),血清HDL-C水平下降了24.88%,說明高脂飲食可以誘發(fā)機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂,出現(xiàn)高血脂癥狀。經(jīng)翅果油、有氧運(yùn)動及聯(lián)合干預(yù)后,相比高脂飲食組(HF),HS、HE和SE組小鼠血脂TG、TC和LDL-C水平發(fā)生不同程度的降低(p<0.05),其中HS、HE和SE三組小鼠血清TG與NC組不具有顯著性差異(p>0.05),HE和SE小鼠血清TC也能降低到正常水平(p>0.05),SE組還能將LDL-C水平降低到正常水平(p>0.05),說明翅果油、有氧運(yùn)動及聯(lián)合干預(yù)均能在一定程度上有效降低高脂飲食引起的血脂升高,改善血脂代謝紊亂,且聯(lián)合干預(yù)效果優(yōu)于單獨(dú)干預(yù)。

圖2 翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動對高脂飲食小鼠血脂及AI值的影響Fig.2 Effects of samara oil and aerobic exercise on serum lipids and AI of high-fat diet mice注:小寫字母不同表示組間差異顯著(p<0.05);圖3，圖5同。

高血脂是引起動脈粥樣硬化的危險因素,一般使用AI值評價引起動脈粥樣硬化的風(fēng)險,由圖2可以看出,經(jīng)過高脂飲食后,HF組小鼠相比NC組AI值顯著升高了4.22倍(p<0.05),而經(jīng)過翅果油、有氧運(yùn)動及聯(lián)合干預(yù)后,AI值分別顯著下降了27.30%、57.05%、65.41%(p<0.05),說明這3種干預(yù)均能在一定程度上降低由高脂飲食誘發(fā)的動脈粥樣硬化的風(fēng)險,且聯(lián)合干預(yù)效果更好。

2.3 翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動對高脂飲食小鼠肝臟指數(shù)的影響

肝臟是脂質(zhì)代謝的主要器官,機(jī)體一旦出現(xiàn)脂代謝紊亂就會對肝臟產(chǎn)生一定的危害,其最直觀的指標(biāo)就是肝臟指數(shù)。由表1的結(jié)果可以看出,相比正常飲食的小鼠,HF組小鼠在經(jīng)過8周的高脂喂養(yǎng)后,肝指數(shù)顯著升高(p<0.05),說明高脂飲食能誘導(dǎo)肝臟發(fā)生一定的病變,可能出現(xiàn)肝臟腫大,充血,炎癥,增生等癥狀[11]。經(jīng)過翅果油、有氧運(yùn)動和聯(lián)合干預(yù)后,各組小鼠肝重和肝指數(shù)相比HF組均顯著下降(p<0.05),并且數(shù)值與NC組不具有顯著性差異(p>0.05),說明三種干預(yù)均有利于改善高脂引發(fā)的肝臟損害。

表1 翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動對小鼠肝重和肝臟指數(shù)的影響Table 1 Effects of samara oil and aerobic exercise on liver weight and liver index of high-fat diet mice

2.4 翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動對高脂飲食小鼠肝臟脂質(zhì)指標(biāo)的影響

各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間肝臟TG和TC的變化如圖3所示,由結(jié)果可以看出,經(jīng)過8周的喂養(yǎng),HF組小鼠肝臟TG和TC水平相比NC組顯著升高了101.19%、89.75%(p>0.05),說明高脂飲食可能誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)的積累。經(jīng)翅果油、有氧運(yùn)動及聯(lián)合干預(yù)后,相比高脂飲食組,HS、HE和SE組小鼠肝臟TG和TC水平顯著降低(p<0.05),且HE和SE組小鼠TG和TC含量與正常飲食組無顯著差異(p>0.05),說明翅果油、有氧運(yùn)動及聯(lián)合干預(yù)對高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累具有一定的改善作用,從改善程度上看,聯(lián)合干預(yù)效果優(yōu)于單獨(dú)干預(yù)。

圖3 翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動對高脂飲食小鼠肝臟TC和TG的影響Fig.3 Effects of samara oil and aerobic exercise on hepatic TC and TG of high-fat diet mice

2.5 翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動對小鼠肝臟組織的影響

各組小鼠肝臟組織石蠟切片H&E染色及肝臟脂肪變性得分如圖4、圖5所示,由結(jié)果可以看出,正常喂養(yǎng)組小鼠肝臟細(xì)胞處于正常形態(tài),肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝板分界明顯,大致呈放射狀,肝板之間清晰可見肝血竇,肝細(xì)胞大小正常,核大而圓,居于肝細(xì)胞中央。高脂飲食組小鼠肝臟組織發(fā)生一定程度的脂肪變性,肝小葉不清晰,肝板分界不明顯,排列紊亂,肝血竇受壓變窄,肝細(xì)胞體積增大,大小不一,細(xì)胞核偏離中央,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡。經(jīng)翅果油干預(yù)后,肝組織脂肪變性得到明顯的改善,胞漿內(nèi)的脂肪空泡明顯變小、減少,一部分肝細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)到正常形態(tài);經(jīng)過有氧運(yùn)動干預(yù)后,肝組織變性得到一定程度的恢復(fù),肝板分界明顯,肝血竇清晰,部分肝細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常,胞漿內(nèi)有少量小的脂肪空泡。類似地,經(jīng)翅果油和有氧運(yùn)動聯(lián)合干預(yù)后,肝組織變性得到很大程度的恢復(fù),肝板分界明顯,排列整齊,肝血竇清晰可見,大部分肝細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài),細(xì)胞核處于細(xì)胞中央,未見脂肪空泡。

圖4 肝臟組織H&E染色(200×)Fig.4 H&E staining of liver tissues(200×)

圖5 肝臟脂肪變性評價Fig.5 Hepatic steatosis grade

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn),過量膳食高脂食物可引起機(jī)體脂肪代謝紊亂,導(dǎo)致機(jī)體血脂異常,長期膳食高脂會增加動脈粥樣硬化及非酒精性脂肪肝發(fā)生的風(fēng)險[13-14]。本實(shí)驗(yàn)以高脂飼料飼喂C57BL/6小鼠8周后,小鼠體重、血脂水平、肝臟系數(shù)、肝臟脂質(zhì)水平都發(fā)生了顯著的升高(p<0.05),并出現(xiàn)了一定程度的肝臟脂肪變性。

據(jù)文獻(xiàn)報道,翅果油富含90%以上不飽和脂肪酸,植物甾醇,維生素E等,且居民熬油食用歷史悠久,具有很好的調(diào)節(jié)脂代謝平衡、抗氧化、預(yù)防心血管疾病等功效[5-9]。陳雨娜[7]比較了膳食翅果油和花生油對正常飲食昆明小鼠抗氧化能力和脂質(zhì)代謝的影響,結(jié)果表明翅果油能有效提高抗氧化能力以及降低血清TC、TG和LDL-C水平。類似地,黃玲等[8]比較了膳食色拉油、VE和翅果油對老齡鼠血清和肝臟抗氧化能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比膳食色拉油,VE和翅果油能顯著降低血清和肝臟MDA含量,增加GSH-Px酶活性,說明翅果油具有很好的抗氧化能力。白誼涵等[9]考察了服用翅果油對高血脂患者血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C的影響,發(fā)現(xiàn)相比未服用的患者,服用翅果油能有效降低高血脂患者血脂水平。從已有報道可以看出,翅果油調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的能力已被證實(shí),然而研究尚處于起步階段,且還未見有翅果油對高脂飲食誘發(fā)的脂代謝紊亂和脂質(zhì)積累方面的研究。此外國內(nèi)外公認(rèn)的改善機(jī)體代謝平衡的方法是中強(qiáng)度有規(guī)律的有氧運(yùn)動[10],有氧運(yùn)動通過增加能量消耗,改善骨骼脂質(zhì)氧化,減少體內(nèi)過多脂肪堆積,從而有效改善血液脂質(zhì)水平紊亂[15-16]。研究發(fā)現(xiàn),有氧運(yùn)動在消耗多余能量時,可能通過上調(diào)β-氧化產(chǎn)生乙酰輔酶A,上調(diào)偶聯(lián)蛋白-1和過氧化物酶增殖物激活的受體C,導(dǎo)致脂肪組織的脂解,從而減輕體內(nèi)脂肪的堆積,降低體重及改善機(jī)體代謝平衡[17-18]。本實(shí)驗(yàn)在喂食高脂飼料的同時給以翅果油、有氧運(yùn)動及翅果油和有氧運(yùn)動聯(lián)合干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種干預(yù)方法均能顯著降低高脂飲食引起的體重增加、血脂水平升高及動脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險,其中效果最突出的是翅果油和有氧運(yùn)動聯(lián)合干預(yù),不僅能使體重降低到正常水平,還可使血清TC、TG和LDL-C降低到正常水平,其次是有氧運(yùn)動,翅果油干預(yù),說明通過飲食的改變結(jié)合有規(guī)律的運(yùn)動能夠有效改善高脂膳食引起的脂代謝紊亂。

過多脂肪的攝入加大了肝臟組織對脂質(zhì)的攝取,破壞肝臟脂代謝平衡,多余的脂質(zhì)以脂滴的形式在肝臟堆積,引起肝組織脂肪變性[19]。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出,高脂飲食組肝臟TG、TC含量顯著升高,肝組織H&E染色出現(xiàn)明顯的脂肪變性。從脂肪的消化、吸收、利用的途徑可以發(fā)現(xiàn),血液中脂質(zhì)水平的升高致使肝臟、脂肪組織對脂質(zhì)的攝入增加,同時脂肪組織過多積累脂肪后還會向血液中釋放游離脂肪酸,導(dǎo)致血液中游離脂肪酸的水平加大[20];脂肪酸通過門靜脈直接進(jìn)入肝臟進(jìn)行合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及氧化利用[21];并且過多脂肪的攝入上調(diào)SREBP-1c的表達(dá),促進(jìn)脂肪合成,阻礙脂肪氧化途徑,從而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)的堆積[22]。研究發(fā)現(xiàn),中強(qiáng)度有氧運(yùn)動可通過調(diào)節(jié)肝臟脂肪合成和脂肪酸β-氧化來改善肝臟脂質(zhì)代謝[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)翅果油、有氧運(yùn)動和聯(lián)合干預(yù)后肝臟脂質(zhì)水平及脂質(zhì)堆積得到了明顯的改善,其中翅果油和有氧運(yùn)動聯(lián)合干預(yù)的作用效果更為明顯,其次是有氧運(yùn)動證實(shí)了運(yùn)動在改善肝臟脂質(zhì)代謝中所起到的重要作用,以及運(yùn)動和飲食相結(jié)合所起到的疊加效應(yīng),然而聯(lián)合干預(yù)是如何改善高脂誘發(fā)的血脂代謝紊亂和脂質(zhì)積累的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

翅果油、有氧運(yùn)動和翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動干預(yù)能夠顯著降低高脂飲食引起的體重增加(p<0.05),血清TG、TC、LDL-C水平的升高(p<0.05),以及降低肝臟TG、TC的堆積(p<0.05),減輕肝臟脂肪變性程度,其中翅果油聯(lián)合有氧運(yùn)動干預(yù)效果優(yōu)于翅果油、有氧運(yùn)動單獨(dú)干預(yù)效果,說明通過攝入翅果油結(jié)合有規(guī)律的有氧運(yùn)動對預(yù)防高血脂、動脈粥樣硬化及脂肪肝的發(fā)生具有一定的作用。