聶三安 ，趙麗霞 ，王祎 ，雷秀美 ，王飛，邢世和 *

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，福建 福州 350002；3. 土壤生態(tài)系統(tǒng)健康與調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；4. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福建 福州 350003）

微生物是土壤中最活躍的組分，不僅參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)過程[1-2]，還在維持土壤生態(tài)功能方面具有不可替代的作用。真菌作為土壤微生物的重要組分，不但與土壤有機(jī)質(zhì)分解、土傳病害傳播等過程密切相關(guān)[3]，同時(shí)也會影響細(xì)菌群落組成[4]，是衡量土壤質(zhì)量和健康的重要指標(biāo)[5]。細(xì)菌是土壤中豐富度最高的微生物，在土壤碳氮循環(huán)過程中具有重要作用[6]，其群落對外界引起的環(huán)境變化特別敏感，被認(rèn)為是反映土壤環(huán)境變化的指示性指標(biāo)[7]。細(xì)菌和真菌多樣性受多種因素的共同調(diào)控，如不同土地利用類型、農(nóng)田土壤管理方式、施肥制度可能引起細(xì)菌和真菌多樣性的變化[8]。細(xì)菌和真菌多樣性的變化會影響?zhàn)B分循環(huán)過程[9]。同時(shí)，土壤微生物群落組成特征是維持土壤肥力水平和作物生產(chǎn)力的重要指標(biāo)[10]，受外界條件變化的深刻影響。因此，開展關(guān)于不同施肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究對于維持土壤功能和生態(tài)系統(tǒng)健康具有重要意義。

黃泥田是南方典型的低產(chǎn)水稻土類型，具有熟化程度低、養(yǎng)分貧瘠、作物產(chǎn)量低等特征[11]。施肥是提高黃泥田水稻產(chǎn)量的重要方式，同時(shí)也會影響微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[12]。許多研究表明，長期施肥明顯改變微生物群落結(jié)構(gòu)，土壤中添加不同肥料均會導(dǎo)致群落組成和多樣性出現(xiàn)差異[13-14]，Wei等[15]研究黑土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性時(shí)，結(jié)果顯示單施氮磷鉀肥可以增加細(xì)菌多樣性；陳丹梅等[16]針對植煙土壤，單施化肥處理明顯提高真菌多樣性指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)并顯著影響真菌的群落結(jié)構(gòu)；孫瑞波等[17]通過對砂姜黑土細(xì)菌群落的研究表明單施化肥處理降低了土壤細(xì)菌的多樣性；通過對水稻土真菌群落的研究，陳丹梅等[18]發(fā)現(xiàn)長期單施化肥會顯著降低真菌多樣性。說明單施化肥對微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響不同。土壤微生物群落與土壤養(yǎng)分狀況密不可分，Yu等[19]通過研究不同施肥處理高活性淋溶土，結(jié)果顯示總氮和有機(jī)碳是影響土壤微生物群落的主要因子；丁建莉等[20]對東北黑土真菌群落結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，真菌群落結(jié)構(gòu)變化與土壤有效磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量具有相關(guān)性。因此，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)可能受多種土壤因子的調(diào)控。由于土壤自身的復(fù)雜性和微生物種類繁多、可培養(yǎng)微生物有限等特點(diǎn)，表征微生物群落和多樣性的方法經(jīng)歷從傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)到分子生態(tài)學(xué)手段的轉(zhuǎn)變。Illumina Miseq 高通量測序可以同時(shí)測定多樣品的可變區(qū)序列，為研究微生物的多樣性及與環(huán)境因子的關(guān)系提供依據(jù)[21]。

有關(guān)不同施肥對黃泥田土壤微生物特性的研究主要集中在探討土壤酶活性與土壤肥力相關(guān)性[22]，而對土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性方面的研究較少。黃泥田土壤細(xì)菌和真菌對不同施肥的響應(yīng)機(jī)制尚不清楚。因此，本研究以福建省農(nóng)科院長期定位試驗(yàn)田為對象，采用高通量測序技術(shù)對土壤細(xì)菌16S rRNA基因和真菌ITS基因進(jìn)行測序，研究長期不同施肥對微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，分析產(chǎn)生差異的土壤因素，為揭示黃泥田土壤微生物對長期不同施肥的響應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)小區(qū)與樣品采集

試驗(yàn)小區(qū)位于閩侯縣白沙鎮(zhèn)福建省農(nóng)科院長期施肥定位監(jiān)測試驗(yàn)田（119°04 ′10" E，26°13 ′31" N）。土壤類型為黃泥田，成土母質(zhì)為低丘紅壤坡積物。該長期定位試驗(yàn)開始于1983年，試驗(yàn)初始耕層土壤基本化學(xué)性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)21.6 g/kg；堿解氮141.0 mg/kg；速效磷 12.0 mg/kg；速效鉀 41.0 mg/kg；pH 4.9。本試驗(yàn)設(shè)不施肥（CK）、單施化肥（NPK）和化肥配施秸稈（NPKS）3個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)小區(qū)面積為12 m2（3m×4m），隨機(jī)區(qū)組排列，種植單季稻。施肥處理年N、P和K輸入量均相同（N 103.5 kg/hm2、P2O527.0 kg/hm2和 K2O 135.0 kg/hm2）。NPK處理100%過磷酸鈣、50%尿素和50%氯化鉀作基肥，剩余的尿素和氯化鉀根據(jù)水稻生育期作追肥。NPKS處理秸稈還田量為4 500 kg/hm2，秸稈有機(jī)質(zhì)含量647.4 g/kg，養(yǎng)分含量分別為N 11.0 g/kg、P2O53.8 g/kg、K2O 20.4 g/kg。

2016年7月水稻種植前采用對角線多點(diǎn)取樣法采集各處理耕層（0～20 cm）土壤樣品，均勻混合后采用四分法保留1 kg樣品裝袋后放入車載冰箱內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，同時(shí)采集耕層容重圈土壤樣品用于土壤孔隙度測定。部分鮮樣用于土壤含水量、微生物生物量碳和氮測定；部分鮮樣用液氮低溫冷卻后放入-80 ℃超低溫冰箱中冷藏，用于分子生物學(xué)分析；其余樣品在室內(nèi)自然風(fēng)干后研磨，用于土壤pH、鹽度、總氮和有機(jī)質(zhì)等指標(biāo)測定。

1.2 土壤相關(guān)理化性質(zhì)分析

土壤微生物生物量碳和氮測定采用液氯熏蒸K2SO4浸提—水浴法[23]，用總有機(jī)碳分析儀（Shimadzu，CN200，日本）進(jìn)行分析。土壤pH測定采用酸度計(jì)（雷磁，PHS-3E，中國）法，以水作浸提劑，土水比為1∶2.5。土壤鹽度測定采用電導(dǎo)率儀法（雷磁，DDSJ-308F，中國），以水為浸提劑，土水比為1∶5。土壤含水量測定采用快速水分測定儀（Sartorius，MA100，德國）直接進(jìn)行測定分析。總氮和有機(jī)質(zhì)測定采用碳氮元素分析儀（Elementar，Vario micro，德國）進(jìn)行分析。土壤孔隙度測定采用環(huán)刀法測定容重，比重瓶法測定比重，通過計(jì)算獲得。

1.3 土壤分子生物學(xué)分析

1.3.1 DNA提取 稱取0.25 g新鮮土壤，采用PowerSoil DNA試劑盒（MoBio Laboratories，美國）的說明方法提取土壤總DNA。得到的DNA用80μl DES溶解，依照Agarose Gel DNA Purification Kit（Takara Bio Inc.，日本）方法進(jìn)行純化。純度用超微量紫外分光光度計(jì)Nanodrop ND-2000（Nanodrop Tech-nologies，美國）進(jìn)行檢測。

1.3.2 目標(biāo)片段擴(kuò)增和高通量測序 細(xì)菌采用16S V4區(qū)515F和806R為引物[24]，對目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，真菌以ITS1和ITS2為引物[25]構(gòu)成的PCR反應(yīng)體系對目的DNA片段（ITS1區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)GeneJET Gel Extraction Kit（Thermo Scientific，美國）純化。純化后的產(chǎn)物根據(jù)熒光定量結(jié)果進(jìn)行混合，制備測序文庫，然后通過Illumina Miseq平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3.3 序列分析和種群鑒定 使用QIIME軟件，調(diào)用UCLUST比對工具，對獲得的序列進(jìn)行歸并和OTU劃分，并選取每個(gè)OTU的代表序列。在QIIME軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，通過將每個(gè)OTU代表序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫的模板序列相比對，獲取每個(gè)OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息。細(xì)菌的基因數(shù)據(jù)庫采用Greengenes v13.8，真菌的鑒定采用UNITE數(shù)據(jù)庫（http://unite.ut.ee）比對。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 21.0進(jìn)行方差分析（one-way ANOVA）和顯著性檢驗(yàn)（Duncan法）。采用CANOCO 4.5（Microcomputer Power，Ithaca，美國）進(jìn)行冗余分析（RDA），用R3.1.0軟件計(jì)算高通量測序多樣性指數(shù)，包括多樣性指數(shù)（Shannon index）、優(yōu)勢度指數(shù)（Simpson index）和豐富度指數(shù)（Chao1 index和ACE index）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤基本理化性質(zhì)差異分析

長期施肥對土壤性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。不同處理之間土壤微生物生物量碳/氮含量差異顯著，且NPKS＞NPK＞CK（表1），說明施肥有利于提高土壤中的活性碳源和氮源。NPK和NPKS處理土壤總氮和有機(jī)質(zhì)與CK相比均增加，但CK與NPK處理之間差異不顯著，說明化肥配施秸稈更有利于土壤養(yǎng)分的提高。NPKS處理的含水量和孔隙度均顯著高于CK處理，而NPK處理的含水量和孔隙度均有所降低。NPKS處理土壤鹽分含量顯著高于CK和NPK處理，說明化肥配施秸稈有利于鹽度的提高。與不施肥相比，施肥處理顯著降低土壤pH，且NPK和NPKS處理之間無顯著差異。

與分管副院長沈崇德談話中了解到，這是自2014年，醫(yī)院將“澳新風(fēng)險(xiǎn)管理標(biāo)準(zhǔn)”引入到后勤患者安全體系后的創(chuàng)新探索?！斑@只是醫(yī)院后勤患者安全體系的一角，后面支撐的是有序化、制度化和具體化的風(fēng)險(xiǎn)管理工作?！?/p>

表1 不同施肥處理土壤基本性質(zhì)Table 1 Basic soil properties in three different fertilization treatments

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

細(xì)菌群落及相對豐度對不同施肥的響應(yīng)見表2。結(jié)果顯示，不同施肥黃泥田土壤共鑒定出9個(gè)大細(xì)菌門，分別為酸桿菌（Acidobacteria）、變形桿菌（Proteobacteria）、綠彎菌（Chloroflexi）、放線菌（Actinobacteria）、厚壁菌（Firmicutes）、浮霉菌（Planctomycetes）、硝化螺旋菌（Nitrospirae）、牙單胞菌（Gemmatimonadetes）和綠菌（Chlorobi），還有其它相對豐度較低（不同處理均低于1%）和至今數(shù)據(jù)庫不能鑒定的細(xì)菌門。

從門水平上來說，不同處理間細(xì)菌群落組成的相對豐度也不盡相同。不同處理之間Acidobacteria相對豐度為17.08%～19.01%，且各處理之間無顯著差異（P＞0.05）。NPK和NPKS處理Proteobacteria相對豐度分別為19.19%和22.11%，顯著高于CK處理（15.16%）。NPK和NPKS處理Chloroflexi相對豐度顯著低于CK處理（P＜0.05）。另外，與CK處理相比，NPK處理的Actinobacteria相對豐度（3.95%）無顯著差異，而NPKS處理Actinobacteria相對豐度顯著提高（4.71%）。不同處理之間Firmicutes相對豐度無顯著差異（P＞0.05）。說明施肥有利于Proteobacteria和Actinobacteria在黃泥田土壤中的富集，尤其是有機(jī)無機(jī)肥配施，但可能會降低Chloroflexi在土壤中的富集。此外，不同處理Planctomycetes、Nitrospirae、Gemmatimonadetes 和Chlorobi的相對豐度也具有一定差異。

表2 不同施肥處理土壤門和目水平細(xì)菌群落組成及相對豐度（%）Table 2 Relative abundance in taxonomic compositions of bacterial community at the Pylum and Order level in three different fertilization treatments (%)

從目水平來看，不同施肥黃泥田土壤細(xì)菌群落主要由29個(gè)目組成（表2）。Acidobacteria中，NPKS處理Acidobacteriales相對豐度（5.81%）顯著低于CK處理（9.10%），但NPK處理與CK處理之間不存在顯著性差異；NPK和NPKS處理均提高Solibacterales的相對豐度，但NPKS的相對豐度提高幅度不顯著；NPK和NPKS處理Ellin6513相對豐度（分別為2.67%和2.73%）顯著低于CK處理；NPKS處理的MVS-40、iii1-15和CCU-21相對豐度均顯著高于CK，而NPK處理與CK處理相比較無顯著差異。Proteobacteria中，CK處理Rhizobiales、Myxococcales和Xanthomonadales的相對豐度均與NPK處理差異不顯著，但均顯著低于NPKS；NPK和NPKS處理Rhodospirillales和Syntrophobacterales的相對豐度分別為3.08%和3.30%與2.11%和2.09%，顯著高于CK處理；NPKS處理的BPC076相對豐度（0.42%）顯著低于CK處理（0.88%），但NPK的相對豐度高于CK，增加幅度未達(dá)到顯著水平；與CK相比，SBla14相對豐度在NPK處理中顯著增加，但在NPKS顯著下降。關(guān)于Chloroflexi，不同施肥對各細(xì)菌目的影響不同。Actinobacteria中，NPK和NPKS處理Actinomycetales相對豐度（2.65%左右）顯著高于CK處理；Acidimicrobiales相對豐度在CK處理（1.42%）顯著低于NPKS處理（2.06%），但在NPK處理（1.28%）有所下降，且差異未達(dá)到顯著水平。Firmicutes中，總體來看，CK處理Bacillales和Lactobacillales的相對豐度高于NPK和NPKS處理。另外，未鑒定目中，不同施肥處理具有顯著差異，表現(xiàn)為NPKS＞NPK＞CK。因此，不同施肥對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響存在較大差異。

2.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

不同施肥對黃泥田土壤真菌群落組成及相對豐度的影響見表3。結(jié)果表明，黃泥田土壤的真菌主要由子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）組成，其它相對豐度較低（不同處理均低于1%）和未鑒定的真菌門。總體上來說，不同處理真菌的相對豐度 趨 勢 為 Ascomycota＞Basidiomycota＞Zygomycota。從門水平上來看，不同處理間真菌群落組成的相對豐度也不盡相同。NPKS處理Ascomycota相對豐度（47.30%）顯著低于CK處理（70.80%），而NPK處理（73.90%）與CK處理差異不顯著。說明有機(jī)無機(jī)肥配施不利于Ascomycota在土壤中的生長和繁殖。Basidiomycota在NPKS處理中的相對豐度為28.05%，顯著高于CK處理（14.15%），但在NPK處理中的相對豐度為9.75%，顯著低于CK處理，說明Basidiomycota對單施化肥和化肥配施秸稈的響應(yīng)不同。NPK和NPKS處理的Zygomycota相對豐度（分別為8.75%和7.90%）顯著高于CK處理（4.70%），說明施肥有利于Zygomycota在黃泥田土壤中的相對豐度的提高。

從目水平來說，不同施肥黃泥田土壤真菌群落主要由12個(gè)真菌目構(gòu)成（表3）。Ascomycota中，不同施肥處理之間Sordariales相對豐度（分別為13.90%和12.65%）無顯著差異，但顯著高于CK處理（8.55%）；Hypocreales、Pleosporales和其它目相對豐度在NPK和NPKS處理顯著低于CK處理；與CK處理相比，NPKS處理Eurotiales的相對豐度較CK顯著降低，但NPK與CK處理無顯著差異；NPKS處理Helotiales相對豐度高于CK，差異未達(dá)到顯著性水平，而NPK處理Helotiales相對豐度比CK顯著降低；另外，在未鑒定目中，不同處理具有顯著差異，表現(xiàn)為NPK＞CK＞NPKS。Basidiomycota中，與CK相比，NPKS處理顯著提高Tremellales的相對豐度，但Tremellales的相對豐度在NPK處理中顯著降低；NPKS處理Trechisporales的相對豐度（10.55%）顯著高于CK處理（3.00%），而NPK處理的相對豐度（1.25%）與CK相比較差異不顯著；CK處理Agaricales相對豐度顯著高于NPK處理，但NPKS與另外兩個(gè)處理之間無顯著差異；不同施肥對Cantharellales的相對豐度影響顯著，均顯著低于CK；CK處理的Sebacinales、其它目和未鑒定目相對豐度與NPK處理之間無顯著差異，但顯著低于NPKS處理。Zygomycota中，Mortierellales在NPK處理的相對豐度（3.40%）顯著高于CK處理（2.75%），但在NPKS處理的相對豐度為2.65%，與CK處理之間無顯著差異；CK處理Basidiobolales的相對豐度（1.95%）顯著低于NPK和NPKS處理（均為5.25%）。以上結(jié)果表明，不同施肥對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響方式存在較大差異。

表3 不同施肥處理門和目水平真菌群落組成及相對豐度（%）Table 3 Relative abundance in taxonomic compositions of fungal community at the Pylum and Order level in three different fertilization treatments (%)

2.4 土壤細(xì)菌和真菌的α多樣性

對原始序列進(jìn)行抽平獲得有效序列，通過R軟件對樣品OTUs進(jìn)行多樣性分析得計(jì)算結(jié)果（表4）。從細(xì)菌的α多樣性來看，不同處理之間Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。CK處理與NPKS處理的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于NPK處理（P＜0.05）。說明單施化肥會降低細(xì)菌的物種數(shù)目。比較真菌的α多樣性發(fā)現(xiàn)，NPKS處理的α多樣性指數(shù)與CK處理相比均無顯著差異（P＞0.05），而NPK處理的α多樣性指數(shù)均顯著低于CK處理（P＜0.05）。說明單施化肥可降低黃泥田真菌的α多樣性。

表4 不同施肥處理土壤細(xì)菌和真菌α多樣性指數(shù)Table 4 Bacterial and fungal diversity parameters in three different fertilization treatments.

2.5 微生物多樣性與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

為研究微生物群落組成與土壤環(huán)境因子的關(guān)系，采用冗余分析（RDA）對不同處理環(huán)境因子與微生物群落間的關(guān)系進(jìn)行限制性排序。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的關(guān)系（圖1a），第一軸和第二軸分別解釋85.3%和14.7%的變化。NPKS處理群落結(jié)構(gòu)的土壤影響因子集中分布在第一排序軸正半軸上，它們的相關(guān)性依次為鹽度（r=0.980）、孔隙度（r=0.971）、總氮（r=0.962）、微生物生物量氮（r=0.958）、有機(jī)質(zhì)（r=0.946）、微生物生物量碳（r=0.906）和含水量（r=0.893）。CK處理的群落結(jié)構(gòu)變化主要受pH高低影響，且pH在第一軸和第二軸的相關(guān)系數(shù)分別為-0.738和-0.675。NPK處理的群落結(jié)構(gòu)變化與選取影響因子的相關(guān)性較小。由此可知，除了pH之外，已分析的土壤環(huán)境因子均是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子。

真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化環(huán)境因子的關(guān)系（圖1b），第一軸和第二軸的解釋量分別為88.5%和11.5%。其中，NPK處理的群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境影響因子的相關(guān)性相對較小，CK處理的群落結(jié)構(gòu)與pH的變化有關(guān)，而NPKS處理的群落結(jié)構(gòu)與這些環(huán)境影響因子均具有相關(guān)性（pH除外）。NPKS處理群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境影響因子集中分布在第一排序軸正半軸上，它們的相關(guān)性為含水量（r=0.999）、孔隙度（r=0.970）、鹽度（r=0.959）、總氮（r=0.721）、微生物生物量氮（r=0.710）、有機(jī)質(zhì)（r=0.684）和微生物生物量碳（r=0.602）。說明NPKS處理真菌群落結(jié)構(gòu)的變化與這些環(huán)境因子均呈正相關(guān)性，主要影響因子為含水量、鹽度、孔隙度，其次為總氮、微生物生物量氮、有機(jī)質(zhì)和微生物生物量碳。綜上，影響細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子相似，但是影響因子的相關(guān)性大小存在一定差異。

圖1 不同施肥處理土壤目水平細(xì)菌群落（a）和真菌群落（b）與土壤環(huán)境因子的RDA分析Fig. 1 RDA analysis of bacterial (a) and fungal (b) compositions at order-level taxonomy in different fertilization treatment soils注：● CK（不施肥）；▲ NPK（單施化肥）；★ NPKS（化肥配施秸稈）；Moisture—含水量，Porosity—孔隙度，EC—鹽度，TN—總氮，SOM—土壤有機(jī)質(zhì)，Cmic—微生物生物量碳，Nmic—微生物生物量氮。

3 討論

不同施肥對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生一定影響。本研究表明，不同施肥黃泥田土壤細(xì)菌主要為Acidobacteria、Proteobacteria和 Chloroflexi，其次是Actinobacteria和Firmicutes（表2）。不同學(xué)者對紅壤性水稻土的研究也表明細(xì)菌主要由Acidobacteria、Proteobacteria、Chloroflexi、Firmicutes 和Actinobacteria組成[26-27]。施肥處理（NPK和NPKS）中Proteobacteria和Actinobacteria的相對豐度高于不施肥處理（CK），尤其是有機(jī)無機(jī)肥配施（NPKS）。說明施肥能夠?yàn)镻roteobacteria和Actinobacteria的生長提供良好的生存環(huán)境，有機(jī)無機(jī)肥配施的效果更顯著。Chloroflexi在施肥處理中（NPK和NPKS）的相對豐度較不施肥處理顯著下降。說明單施化肥和化肥配施秸稈均不利于Chloroflexi的生長。原因可能是長期施肥導(dǎo)致土壤基本性質(zhì)發(fā)生改變，抑制Chloroflexi的生長，但促進(jìn)Actinobacteria和Proteobacteria的生長。施肥（NPK和NPKS）在一定程度上能夠降Planctomycetes的相對豐度，但顯著提高Chlorobi的相對豐度。說明施肥在一定范圍內(nèi)抑制Planctomycetes的生長，明顯促進(jìn)Chlorobi的生長。Nitrospirae和Gemmatimonadetes對單施化肥和化肥配施秸稈的響應(yīng)方式均具有明顯區(qū)別。綜上，施肥可以改變細(xì)菌群落組成，影響群落內(nèi)物種數(shù)目變化和群落結(jié)構(gòu)變化。

細(xì)菌多樣性分析結(jié)果表明（表4），有機(jī)無機(jī)肥配施處理能在一定程度上提高細(xì)菌的α多樣性，但并未達(dá)到顯著水平，而單施化肥顯著降低細(xì)菌的豐富度指數(shù)。有研究表明有機(jī)無機(jī)肥施用能夠提高細(xì)菌的多樣性[28]，而本研究結(jié)果表明化肥配施秸稈對土壤細(xì)菌多樣性無顯著影響，這可能與黃泥田土壤本身的特征有關(guān)。黃泥田土壤熟化程度低，養(yǎng)分貧瘠[11]，盡管添加無機(jī)肥配施秸稈能在一定程度上提高土壤養(yǎng)分（表1），但并不能顯著提高細(xì)菌的α多樣性。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，也有研究發(fā)現(xiàn)單施化肥顯著降低細(xì)菌的豐富度指數(shù)[29]，本研究的結(jié)果也證明了單施化肥會降低土壤細(xì)菌群落內(nèi)物種數(shù)目。原因可能在于單施化肥在一定程度上降低土壤含水量和通氣狀況導(dǎo)致土壤板結(jié)，不利于好氧細(xì)菌的生長，從而降低土壤細(xì)菌群落的物種數(shù)目?？梢姡煌┓蕦ν寥兰?xì)菌多樣性的影響不同。

真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性對不同施肥的響應(yīng)方式存在明顯差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同施肥黃泥田土壤真菌主要由Ascomycota、Basidiomycota和Zygomycota三大真菌類群構(gòu)成（表3）。也有研究結(jié)果表明Ascomycota和Basidiomycota是土壤中的優(yōu)勢真菌類群[30]。Ascomycota在化肥配施秸稈中的相對豐度顯著低于不施肥處理，但單施化肥處理與不施肥處理無顯著性差異。說明化肥配施秸稈明顯不利于Ascomycota的生長。丁建莉等[20]研究東北黑土真菌群落結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)無機(jī)肥和有機(jī)無機(jī)肥配施均可提高Ascomycota的相對豐度，與本研究結(jié)果具有較大差異。一方面是黃泥田土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量較低，不利于Ascomycota的生長繁殖；另一方面是施用秸稈作為有機(jī)肥，秸稈中含有大量的氮磷鉀營養(yǎng)元素，土壤中施入過高的氮肥會促進(jìn)真菌產(chǎn)生病原特征[31]，導(dǎo)致Ascomycota的生長活動受到抑制。Zygomycota的相對豐度在單施化肥和化肥配施秸稈處理均顯著高于不施肥處理，施肥提高土壤中Zygomycota的含量。說明施肥能夠供給Zygomycota生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)，且為其生存創(chuàng)造適宜的條件。Basidiomycota的相對豐度在化肥配施秸稈中顯著增加，而在單施化肥中明顯下降。說明有機(jī)無機(jī)肥配施可以促進(jìn)Basidiomycota的生長，而單施化肥具有相反的作用。原因可能是有機(jī)無機(jī)肥配施提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤的通氣狀況，為其生存創(chuàng)造有利條件，而單施化肥造成土壤理化性質(zhì)惡化、土壤板結(jié)，不適宜于Basidiomycota的生長繁殖。

真菌多樣性分析結(jié)果顯示（表4），單施化肥顯著降低真菌α多樣性指數(shù)，而化肥配施秸稈在一定程度上提高真菌α多樣性指數(shù)，說明單施化肥會顯著降低真菌的多樣性。原因可能是黃泥田土壤長期處于養(yǎng)分虧缺狀態(tài)[11]，施用化肥輸入土壤的養(yǎng)分種類及含量有限，供給真菌生長的能源和營養(yǎng)物質(zhì)不足，使得原本適宜生存的種群減少，降低了真菌的多樣性。陸海飛等[32]研究結(jié)果表明不同施肥處理間土壤真菌的香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)并無顯著差異，但本研究表明化肥配施秸稈處理顯著高于單施化肥處理，造成這種差異的原因可能與土壤類型和施用肥料種類有關(guān)。另外，NPKS處理中真菌多樣性顯著高于NPK處理可能與有機(jī)物料的投入有關(guān)。原因在于很多真菌都是異養(yǎng)型的，有機(jī)物料在分解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物能夠?yàn)檎婢a(bǔ)充能源和碳氮源，因而有機(jī)物料的投入有利于其生長繁殖[33]。

本研究表明，有機(jī)無機(jī)肥配施能夠顯著增加土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮、有機(jī)質(zhì)、總氮、孔隙度、含水量和鹽度（表1）。施用有機(jī)肥能夠向土壤中輸入豐富的有機(jī)質(zhì)，提高活性有機(jī)物質(zhì)含量，促進(jìn)微生物的生長活動，增加土壤微生物生物量碳/氮含量[34-35]。有機(jī)無機(jī)肥配施也可以改善土壤通氣狀況和含水量[36]，本研究結(jié)果也表明了這一特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)無機(jī)肥施用可以明顯降低土壤pH值，而有機(jī)無機(jī)肥配施能夠有效緩解土壤酸化[37]，但本研究結(jié)果表明單施化肥和化肥配施秸稈均顯著降低土壤pH。這可能與施用秸稈為有機(jī)肥有關(guān)，秸稈還田后會增加土壤中有機(jī)酸含量，而土壤pH值與有機(jī)酸含量呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)性[38]。因此，不同施肥對土壤基本性質(zhì)具有不同影響。

RAD分析結(jié)果表明，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與鹽度、孔隙度、總氮、微生物生物量氮、有機(jī)質(zhì)、微生物生物量碳和含水量關(guān)系密切，真菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子是含水量、孔隙度和鹽度，其次為微生物生物量氮、總氮、有機(jī)質(zhì)和微生物生物量碳，而土壤pH值對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響相對較小（圖1）。很多研究表明土壤水分和通氣狀況是微生物生長的重要條件[39-40]，鹽分高低在一定程度上影響著微生物生物量碳的分解與轉(zhuǎn)化過程，且微生物生物量碳是反映有機(jī)質(zhì)周轉(zhuǎn)的重要參數(shù)[41]，進(jìn)一步影響群落結(jié)構(gòu)變化。戴雅婷等[42]研究也發(fā)現(xiàn)全氮和有機(jī)質(zhì)是影響細(xì)菌群落組成的重要因素。有機(jī)質(zhì)和全氮對真菌群落結(jié)構(gòu)的變異也具有顯著影響[43]。施用有機(jī)肥可以提高土壤肥力水平，同時(shí)輸入豐富的有機(jī)質(zhì)，能滿足微生物的生長繁殖，提高土壤微生物生物量碳/氮含量[44]，改變微生物群落結(jié)構(gòu)。有研究顯示土壤pH值對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生深刻影響[45]，而我們研究結(jié)果顯示土壤pH值對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響相對較小，原因可能是施肥后土壤pH值變化幅度（表1）不足以對微生物群落產(chǎn)生足夠影響。綜上，黃泥田土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)受主要土壤理化性質(zhì)的綜合調(diào)控。

本研究著重于研究不同施肥對黃泥田水稻土微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響及其與土壤環(huán)境因子，為揭示黃泥田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性對不同施肥的響應(yīng)機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。稻田土壤微生物還受不同水稻品種和水稻不同生育期的影響[46-47]，另外，微生物功能也是反映土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，且深受人為因素的影響，微生物功能如何響應(yīng)土地類型和田間管理措施有待深入研究。

4 結(jié)論

1）黃泥田土壤細(xì)菌主要種群是Acidobacteria、Proteobacteria、Chloroflexi、Firmicutes和 Actinobacteria；真菌群落主要由Basidiomycota、Ascomycota和Zygomycota構(gòu) 成。Acidobacteria、Firmicutes和Chloroflexi的相對豐度在施肥處理中有所下降，而Proteobacteria和Actinobacteria有所上升。有機(jī)無機(jī)肥配施能著降低Ascomycota的相對豐度，而顯著增加Basidiomycota在土壤中的相對豐度。同時(shí)，化肥配施秸稈和單施化肥均顯著增加Zygomycota的相對豐度，細(xì)菌和真菌主要種群的相對豐度對不同施肥的響應(yīng)不同。

2）長期施肥能夠改變細(xì)菌和真菌的多樣性。與不施肥相比，化肥配施秸稈的真菌α多樣性和細(xì)菌豐富度指數(shù)差異不顯著；而單施化肥顯著降低真菌的α多樣性和細(xì)菌的豐富度指數(shù)。不同施肥對土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)并無顯著影響。

3）長期施肥可以通過改變土壤養(yǎng)分含量和理化性狀對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子均具有較高的正相關(guān)性（pH除外），真菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子為含水量、鹽度和孔隙度，其次為總氮、微生物生物量氮、有機(jī)質(zhì)和微生物生物量碳，pH的影響最小。