覃海媚 王榮 龐曉霞 凌正寶 劉忠林 胡仁統(tǒng) 王俊利

【摘要】 目的 探討RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數(shù)變異（copy number variant， CNV）與鼻咽癌的相關(guān)性研究。方法 采用多重基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)（AccuCopyTM）對179例鼻咽癌樣本和200例健康體檢者樣本進(jìn)行RTN4基因外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數(shù)檢測，觀察兩組樣本基因拷貝數(shù)變異情況，運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計比較兩組拷貝數(shù)分布的差異性。結(jié)果 鼻咽癌患者和健康體檢者的RTN4基因外顯子區(qū)的拷貝數(shù)主要以2個拷貝為主，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)這兩組的拷貝數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。結(jié)論 RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)拷貝數(shù)變異可能與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展無相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 RTN4基因；外顯子區(qū)；拷貝數(shù)變異；鼻咽癌

中圖分類號：R739.63 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.002

【Abstract】 Objective To investigate correlation between copy number variants （CNVs） of 9 target fragments in the exon regions of RTN4 gene （54972187-55137831） and nasopharyngeal carcinoma （NPC）.Methods The copy number of 9 target fragments in the exon regions of RTN4 gene of 179 NPC samples and 200 healthy subjects were tested by multiplex gene copy number detection（AccuCopyTM）.Then，CNVs of the two group were observed，and the difference of copy number distribution between the two groups was compared by mathematical statistics.Results The number of copies of RTN4 gene exon in patients with NPC and healthy subjects was mainly two copies，and it was found that there was no statistically significant difference in the number of copies between the two groups（all P>0.05）.Conclusion There may be no correlation between CNVs of the exon region of RTN4 gene （54972187-55137831） and the development of NPC.

【Key words】 RTN4 gene；exon region；CNVs；NPC

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種好發(fā)于頭頸部上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病率具有明顯的地域聚集性，其發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜，確切病因仍未完全闡明，給有效防治帶來了極大困難。目前認(rèn)為，引起鼻咽癌的病因除了EB病毒感染、環(huán)境因素影響之外[1～2]，遺傳因素在鼻咽癌的發(fā)生中也起了重要的作用[3～4]?？截悢?shù)變異（Copy number variants，CNVs）是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的，一般指長度為1 kb 以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，是各種疾病的遺傳變異的重要來源。已有文獻(xiàn)報道，一些基因CNVs與鼻咽癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、食管癌等[5～8]多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。RTN4基因是一種軸索生長抑制因子，又名Nogo基因（Neurite growth inhibitor），其編碼的蛋白是網(wǎng)狀蛋白家族第四成員（reticulon protein，RTN4），且具有抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元軸突再生和介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。但RTN4基因CNVs在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中是否起作用，目前尚不清楚。因此，本研究初步探究RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數(shù)變異與鼻咽癌的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月～2017年1月來自我院的179例鼻咽癌患者和200例健康體檢者進(jìn)行實驗研究。其中鼻咽癌組有131例男性和48例女性，平均年齡（47.12±11.38）歲，其納入標(biāo)準(zhǔn)是經(jīng)病理分析確診為鼻咽癌、未經(jīng)放療或化療、無親緣關(guān)系、無其他疾病。選取200例同階段、年齡匹配的健康體檢者作為對照組，男性144例，女性56例，平均年齡（45.69±12.23）歲，其納入標(biāo)準(zhǔn)是研究對象之間無親緣關(guān)系，且臨床體格檢查、實驗室指標(biāo)都正常，并排除具有遺傳病和其他病史。本實驗經(jīng)過所有研究對象知情同意，并得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA提取

用乙二胺四乙酸二鉀（EDTAK2）抗凝管收集研究對象3 ml靜脈血備用。按照血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根）說明書提取研究樣本的DNA，收集到無菌EP管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RTN4基因拷貝數(shù)檢測

本實驗采用上海天昊遺傳分析中心的AccuCopyTM多重基因拷貝數(shù)檢測試劑盒對179個鼻咽癌樣本和200個健康體檢者進(jìn)行9個目的片段拷貝數(shù)檢測，并根據(jù)實驗要求合成特異引物（見表1）。首先進(jìn)行PCR擴(kuò)增：取2 μL基因組DNA模板與2 μL內(nèi)對照DNA混合液混勻，再加入10 μL模板 2×PCR Master Mix、1 μL多重PCR引物混合液和5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)程序為95℃ 10 min；11 循環(huán) （94℃ 20s，65℃ 40 s，72℃ 1.5 min）；24循環(huán) （94℃ 20s，59℃ 30s，72℃ 1.5 min）；60℃ 60 min；4℃?zhèn)溆?。擴(kuò)增后將1 μL PCR產(chǎn)物稀釋10倍，再取其中1 μL 與0.5 μL 分子量內(nèi)對照（GeneScanTM -500 Liz Size Standard）、8.5 μL高度去離子甲酰胺（highly deionized-formamide，Hi-Di）混勻，經(jīng)95℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀進(jìn)行檢測（重復(fù)三次實驗取平均值）。最后，根據(jù)相應(yīng)基因的樣本DNA或者是內(nèi)對照DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的長度及熒光標(biāo)記信息，利用GeneMapper 5.0對ABI3730XL測序儀生成的數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床特征的比較

兩組年齡、性別、吸煙、飲酒等臨床特征比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.2 RTN4基因拷貝數(shù)的頻率分布及與鼻咽癌相關(guān)性

在所有研究樣本中，RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)9個目的片段的拷貝數(shù)變異檢測結(jié)果有1拷貝、2拷貝、3拷貝和4拷貝，其中以2個拷貝數(shù)占比為主；RTN4基因外顯子區(qū)（E02-03、E05、E06、E07、E08、E09）拷貝數(shù)檢測結(jié)果均為2，故沒有進(jìn)行鼻咽癌組和對照組的比較；而RTN4基因外顯子區(qū)E01和E10拷貝數(shù)檢測結(jié)果有2拷貝和3拷貝；RTN4基因外顯子區(qū)E11拷貝數(shù)檢測結(jié)果有1拷貝、2拷貝和4拷貝，也以2個拷貝數(shù)為主。通過比較鼻咽癌組和正常組RTN4基因外顯子區(qū)（E01、E10、E11）拷貝數(shù)分布差異，發(fā)現(xiàn)兩組的拷貝數(shù)分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。表明RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)9個目的片段的拷貝數(shù)變異可能與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險不存在相關(guān)性。

3 討論

RTN4基因位于2號染色體短臂，其長度約75 kb[9]。RTN4基因可通過不同的剪切方式編碼出三種蛋白質(zhì)，分別是Nogo-A、 Nogo-B和Nogo-C 蛋白。其中Nogo-A蛋白參與抑制中樞神經(jīng)軸突再生和腫瘤細(xì)胞凋亡過程[10]；Nogo-B 高度表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，其參與腫瘤細(xì)胞凋亡、組織損傷修復(fù)和血管內(nèi)皮再生等病理生理過程[11]；而Nogo-C蛋白分子的具體功能目前尚不十分明確。絕大多數(shù)鼻咽癌屬于低分化的鱗狀細(xì)胞癌，惡性程度極高，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。隨著人類基因組計劃完成，基因與鼻咽癌的相關(guān)性越來越受到廣泛學(xué)者的關(guān)注[12～14]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RTN4基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性相關(guān)，位點rs2588510和rs1348528的單倍型CG、TA可增加鼻咽癌易感性；而rs2864052和rs6545468位點的單倍型AG則可降低鼻咽癌易感性[15～16]。而本研究未發(fā)現(xiàn)RTN4基因外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數(shù)變異與鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)性。

Yang L等[17]經(jīng)TaqMan方法檢測鼻咽癌患者和對照組的絲裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶2（MAPKAPK2）啟動子拷貝數(shù)（CNV-30450），發(fā)現(xiàn)CNV-30450拷貝數(shù)增加與鼻咽癌患病風(fēng)險增加有關(guān)。認(rèn)為可能存在的機(jī)制是CNV-30450拷貝數(shù)增加可以增強(qiáng)MAPKAPK2的啟動子活性，從而提高M(jìn)APKAPK2的表達(dá)。Tse KP等[5]經(jīng)利用全基因組SNP陣列和五種CNV預(yù)測算法，發(fā)現(xiàn)位于染色體6p21.3的CNV與鼻咽癌患病率增加相關(guān)聯(lián)。而我們研究顯示鼻咽癌患者RTN4基因外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數(shù)分布與對照組比較差異無統(tǒng)計意義，提示 RTN4基因外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數(shù)變異在鼻咽癌的遺傳發(fā)病機(jī)制中不存在相關(guān)性。當(dāng)然本實驗存在一定的局限性：鼻咽癌組和對照組的研究樣本數(shù)量相對較小，可能不足以發(fā)現(xiàn)兩者RTN4基因外顯子區(qū)拷貝數(shù)變異差異，在今后的研究中我們需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量予以證實。

參 考 文 獻(xiàn)

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