陳玉禮 韋紅玉 唐華英 趙麗娟 曾怡

【摘要】 目的 明確幽門螺桿菌表型與毒力的相關(guān)性，掌握幽門螺桿菌的生物學(xué)特征，為臨床快速了解幽門螺桿菌的毒力并通過(guò)減毒方法防治幽門螺桿菌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 配制含有合適濃度的甲硝唑培養(yǎng)液，用倍比稀釋法使培養(yǎng)液中甲硝唑的濃度為0 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml，分別培養(yǎng)幽門螺桿菌，誘導(dǎo)幽門螺桿菌的形態(tài)發(fā)生球形變，然后用革蘭染色鏡下觀察培養(yǎng)12 h、24 h、48 h時(shí)在不同抗生素濃度下幽門螺桿菌形態(tài)學(xué)的變化，并用Real-time PCR法檢測(cè)不同形態(tài)學(xué)下其細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）和空泡毒素基因（VacA）毒力基因的表達(dá)。結(jié)果 培養(yǎng)12 h時(shí)幽門螺桿菌的形態(tài)未發(fā)生變化；當(dāng)培養(yǎng)24 h時(shí)在16 μg/ml、32 μg/ml濃度抗生素下，一部分幽門螺桿菌由螺旋狀變成了短桿狀；培養(yǎng)48 h時(shí)在16 μg/ml、32 μg/ml濃度抗生素下，幽門螺桿菌幾乎全部變成了圓球狀，其他抗生素濃度下的幽門螺桿菌沒(méi)有形態(tài)學(xué)變化，且球形變時(shí)幽門螺桿菌的CagA和VacA表達(dá)下降。結(jié)論 幽門螺桿菌表型與毒力有密切的關(guān)系，抗生素能誘導(dǎo)幽門螺桿菌發(fā)生形態(tài)學(xué)變化且球形變的幽門螺桿菌毒力下降。

【關(guān)鍵詞】 幽門螺桿菌；抗生素；表型；毒力變化

中圖分類號(hào)：R378 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.003

【Abstract】 Objective To clarify relationship between the phenotype and virulence of Helicobacter pylori and to grasp the biological characteristics of Helicobacter pylori，so as to provide experimental evidence for the clinical understanding of the virulence of Helicobacter pylori and the prevention and treatment of it by detoxification.Methods Metronidazole medium containing suitable concentration was prepared.The concentration of metronidazole in the culture medium was 0 μg/ml，2 μg/ml，4 μg/ml，8 μg/ml，16 μg/ml，32 μg/ml by double dilution method，and they were respectively used to culture Helicobacter pylori.The morphology of Helicobacter pylori was induced to be spherical.And then，the morphological changes of Helicobacter pylori at different concentrations of antibiotics were observed under Gram staining microscope at 12 h，24 h and 48 h.In addition，the expression of cytotoxin associated gene（CagA） and vacuolating cytotoxin gene A（VacA） under different morphology were detected by real time PCR.Results The morphology of Helicobacter pylori did not change when culturing for 12 h，while some Helicobacter pylori changed from spiral to short rod under concentrations of 16 g/ml and 32 g/ml when culturing for 24 h.When culturing for 48 h，almost all of the Helicobacter pylori became globular at the concentration of 16 μg/ml and 32 μg/ml，but no morphological changes were found in other concentrations of antibiotics.Furthermore，the expression of CagA and VacA genes in Helicobacter pylori decreased during globular change.Conclusion The phenotype of Helicobacter pylori is closely related to its virulence.Antibiotics can induce morphological changes of Helicobacter pylori and decrease the virulence of the globular Helicobacter pylori.

【Key words】 Helicobacter pylori；antibiotics；phenotype；virulence change

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）與人體胃、十二指腸疾病密切相關(guān)，也是胃癌演變的始動(dòng)因子之一。目前Hp在全世界感染率超過(guò)50%，一些不發(fā)達(dá)地區(qū)甚至可超過(guò)80%[1]。1994年世界衛(wèi)生組織（WHO）已將Hp列為第一類生物致癌因子，2012年2月中國(guó)疾病預(yù)防控制中心對(duì)2008年中國(guó)的癌癥死亡人數(shù)進(jìn)行報(bào)道，其中因?yàn)槲赴┧劳?3.6萬(wàn)例，在惡性腫瘤死亡率中排第二位，可見(jiàn)Hp嚴(yán)重危害人類健康。細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）是CagA PAI中主要的毒力基因，編碼的CagA蛋白分子量為120～145 kDa，其5端長(zhǎng)約900個(gè)氨基酸，為保守區(qū)，3端由若干不等的重復(fù)序列組成，為可變區(qū)[2]。另外，分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)空泡毒素基因（VacA）也是主要的致病因子，CagA+/VacA+的Hp患者消化道潰瘍和胃癌的發(fā)生率明顯升高[3]。有學(xué)者提出Hp感染復(fù)發(fā)可能與細(xì)菌的球形變有關(guān)，并推測(cè)球形Hp可潛伏在機(jī)體中，當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境適合Hp生長(zhǎng)繁殖時(shí)便可引起疾病的再次發(fā)作[4]。那么伴隨著Hp的形態(tài)變化，其毒力將會(huì)如何改變？ 這種改變是表型的變化抑或是基因的變化呢？本研究通過(guò)采用抗生素的誘變作用，使Hp發(fā)生球形變，明確幽門螺桿菌表型與毒力的相關(guān)性，掌握幽門螺桿菌的生物學(xué)特征，為臨床快速了解幽門螺桿菌的毒力并通過(guò)減毒方法防治幽門螺桿菌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

菌株是26695標(biāo)準(zhǔn)菌株，由本實(shí)驗(yàn)所保存，馬血清、革蘭染色試劑盒、CO2產(chǎn)氣袋、腦心浸液培養(yǎng)基、提取RNA試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購(gòu)自卓一生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)用的儀器有：高速冷凍離心機(jī)、渦旋振蕩器、普通PCR擴(kuò)增儀、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、電子顯微鏡、超凈工作臺(tái)、超純水機(jī)、超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 幽門螺桿菌液體培養(yǎng)基（腦心浸液培養(yǎng)基）配制

腦心浸液培養(yǎng)基按照說(shuō)明配制，高壓滅菌冷卻后，每100 ml的培養(yǎng)基中加入5～10 ml的馬血清，放入4℃冰箱備用。

1.2.2 用倍比稀釋法配制含有不同濃度甲硝唑的幽門螺桿菌培養(yǎng)基

稱取適量的甲硝唑，用配制好的腦心浸液培養(yǎng)基溶解成甲硝唑濃度為32 μg/ml的培養(yǎng)液，然后對(duì)此溶液進(jìn)行2倍的倍比稀釋：用滅菌1 ml吸管吸取上述配制好的32 μg/ml抗生素溶液5 ml，沿管壁徐徐注入含有5 ml腦心浸液培養(yǎng)基試管中，輕搖混勻，記為16 μg/ml稀釋度含抗生素培養(yǎng)液。另取滅菌1 ml吸管，按照上述操作方法，進(jìn)行2倍遞增稀釋。如此每遞增稀釋一次，即換用1支1 ml滅菌吸管，依次稀釋至2 μg/ml稀釋度含抗生素培養(yǎng)液，最終配制成0 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml，6組不同濃度甲硝唑的幽門螺桿菌培養(yǎng)基。

1.2.3 在不同濃度甲硝唑的培養(yǎng)基下培養(yǎng)后革蘭染色鏡下幽門螺桿菌的形態(tài)學(xué)變化

將等量標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液分別接種到含有不同濃度的甲硝唑的培養(yǎng)液中，然后置于微需氧的環(huán)境中（10%CO2、5%O2、85%N2），分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后進(jìn)行革蘭染色，并放在鏡下觀察幽門螺桿菌形態(tài)。

革蘭染色鏡檢步驟：（1）涂片：用接種環(huán)取兩環(huán)培養(yǎng)的菌液，放到潔凈的玻片上劃線的區(qū)域，均勻涂開(kāi)，盡量涂薄，自然干燥。（2）固定：將玻片用夾子夾著在酒精燈火焰上方2～3 cm處，來(lái)回3遍，以固定菌體在玻片上。（3）初染：菌體區(qū)域滴加龍膽紫溶液，輕輕晃動(dòng)玻片使其全部覆蓋菌體區(qū)域，染液停留1 min，用自來(lái)水輕輕沖洗玻片，并盡量瀝干水分。（4）媒染：在菌體區(qū)域滴加碘溶液使其覆蓋全部菌體區(qū)域，染液停留1 min左右，用自來(lái)水輕輕沖洗玻片，瀝干水分。（5）脫色：在菌體區(qū)域滴加95%酒精溶液使其覆蓋全部菌體區(qū)域，停留30 s左右，用自來(lái)水輕輕沖洗玻片，瀝干水分。（6）復(fù)染：在菌體區(qū)域滴加沙黃溶液使其覆蓋全部菌體區(qū)域，停留1～2 min，用自來(lái)水輕輕沖洗玻片，瀝干水分，并自然干燥。（7）觀察：待標(biāo)本干燥后置于光學(xué)顯微鏡下，觀察細(xì)菌的染色特征以及形態(tài)特征。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)幽門螺桿菌不同形態(tài)下毒力因子的表達(dá)

將螺桿狀的幽門螺桿菌和圓球狀的幽門螺桿菌按照提取RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟分別提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用Real-time PCR SYBR GreenⅠ法檢測(cè)幽門螺桿菌相關(guān)基因（CagA和VacA）表達(dá)。其qPCR反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系的配制及反應(yīng)程序見(jiàn)表1～表3。

2 結(jié)果

2.1 在不同時(shí)間不同濃度甲硝唑的作用下幽門螺桿菌的形態(tài)學(xué)變化

幽門螺桿菌在培養(yǎng)12 h時(shí)革蘭染色發(fā)現(xiàn)6組不同濃度的幽門螺桿菌的形態(tài)學(xué)沒(méi)有明顯的變化。如表4。幽門螺桿菌形態(tài)變?yōu)閳A球狀從多到少依次定為“++++”“+++”“++” “+”“ -”5個(gè)等級(jí)（每個(gè)+大約代表了25%的幽門螺桿菌球形變）；培養(yǎng)24 h時(shí)發(fā)現(xiàn)只有在32 μg/ml和16 μg/ml濃度下幽門螺桿菌開(kāi)始有螺桿狀變成短桿狀，少部分變成了圓球狀。如表5。當(dāng)培養(yǎng)48 h時(shí)發(fā)現(xiàn)在32 μg/ml和16 μg/ml濃度下幽門螺桿菌幾乎都變成圓球狀，而0 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml濃度幽門螺桿菌的形態(tài)學(xué)幾乎沒(méi)什么變化。如表6。圖1是螺桿狀幽門螺桿菌的革蘭染色圖片，圖2是抗生素誘導(dǎo)下螺桿狀幽門螺桿菌部分變成了短桿狀，圖3是在抗生素長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)下幽門螺桿菌由短桿狀變成了圓球形。

2.2 用Real-time PCR檢測(cè)不同形態(tài)下幽門螺桿菌的毒力因子的變化

Real-time PCR結(jié)果如圖4顯示，用甲硝唑誘導(dǎo)后變成圓球狀的幽門螺桿菌比誘導(dǎo)前螺旋狀態(tài)的幽門螺桿菌的毒力因子VacA和CagA降低。

3 討論

自從Hp被成功分離以來(lái)，世界各地對(duì)其基礎(chǔ)與臨床的研究日益深入。對(duì)于Hp球形體的活力和致病性存在兩種不同的看法，一種認(rèn)為Hp球形體是一種退化、死亡的菌體，不具有感染力和致病性[5]；而另一種認(rèn)為Hp從典型的螺旋桿狀到球形體的變化可能是對(duì)不利環(huán)境的一種短暫適應(yīng)，當(dāng)環(huán)境重新恢復(fù)至對(duì)Hp生長(zhǎng)有利時(shí)，它有可能會(huì)恢復(fù)成可增殖的螺桿狀而重新致病[6]。本實(shí)驗(yàn)采用6個(gè)濃度梯度甲硝唑溶液，作用于幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)菌株的球形變，分別作用12 h、24 h、48 h后革蘭染色顯微鏡下觀察，可以看到螺旋狀、S形或海鷗狀等不規(guī)則的革蘭氏陰性彎曲桿菌。但是發(fā)現(xiàn)隨著甲硝唑濃度增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，顯微鏡下除了典型的彎曲桿菌，還可見(jiàn)球形的幽門螺桿菌，視野中混雜著不規(guī)則的桿狀和球形的幽門螺桿菌，直到最后完全球形變，說(shuō)明了在不利于生長(zhǎng)環(huán)境下，幽門螺桿菌發(fā)生了由螺桿狀逐漸變成短桿狀最后變成球形的變化，趨于穩(wěn)定，以適應(yīng)環(huán)境的變化，并且毒力因子的表達(dá)量降低，進(jìn)一步說(shuō)明雖然抗生素能降低其毒力，但并未完全喪失其毒力，本實(shí)驗(yàn)為臨床快速了解幽門螺桿菌的毒力并通過(guò)減毒方法防治幽門螺桿菌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為下一步當(dāng)環(huán)境恢復(fù)到有利于Hp生長(zhǎng)時(shí)，其形態(tài)學(xué)和毒力因子的變化打下了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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