張麗君，王 英，張 燕，簡(jiǎn) 琛，金 剛，代建國

(1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳 518055； 2.廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系，廣東廣州 510405)

陽離子抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)鱟素Ⅰ(tachyplesin Ⅰ)由Nakamuro等首次從中國鱟(Tachypleustridentatus)血細(xì)胞分離純化制得[1]，分子量為2 263 u，一級(jí)結(jié)構(gòu)由17個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，含有2個(gè)二硫鍵；二級(jí)結(jié)構(gòu)呈典型的反平行β-折疊結(jié)構(gòu)，疏水的氨基酸殘基定位于平面一側(cè)，分子中6個(gè)陽離子氨基酸殘基主要分布在分子的尾部。鱟素Ⅰ具有抗細(xì)菌[2]、抗真菌[3]、抗病毒[4]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化[5]以及顯著調(diào)控動(dòng)物腸道微生物菌群[6]的功能，極具潛在廣泛的應(yīng)用價(jià)值。然而，天然鱟素Ⅰ來源非常受限，人工合成價(jià)格非常昂貴，因此基因重組制備成為規(guī)模化獲取鱟素Ⅰ的重要途徑。

鱟素Ⅰ對(duì)常見基因工程宿主的廣泛和強(qiáng)烈的抑殺活性[7-8]使其高效表達(dá)異常艱難，融合表達(dá)雖可降低鱟素Ⅰ對(duì)工程宿主的抑殺活性，但因特異性蛋白酶價(jià)格昂貴和后續(xù)切割精度難以保證而無法得到有效應(yīng)用。因此，從天然微生物篩選得到耐受鱟素Ⅰ抑殺的宿主以提高鱟素Ⅰ的表達(dá)效率值得期待。本課題組比較了鱟素Ⅰ對(duì)大腸桿菌(BL21)、枯草芽孢桿菌(WB800、BS168)、酵母菌(GS115)、小球藻和絲狀真菌里氏木霉(QM9414)等常見工程宿主的抑殺活性，發(fā)現(xiàn)絲狀真菌里氏木霉對(duì)鱟素Ⅰ的耐受能力最強(qiáng)[7-8]。迄今為止，抗菌肽能否在里氏木霉中獲得有效表達(dá)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬構(gòu)建鱟素Ⅰ-里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)，探索鱟素Ⅰ在此表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 里氏木霉表達(dá)載體pAN-PSGT和里氏木霉(QM9414)，均由深圳大學(xué)劉剛教授惠贈(zèng)；大腸桿菌(Escherichiacoli) Competengt Cell JM109，購自大連TaKaRa公司。

1.1.2 試劑 質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、DNA連接試劑盒、Trizol試劑盒和兩步法RT-PCR試劑盒以及蛋白質(zhì)Marker，均購自TaKaRa公司；溶壁酶、氨芐青霉素和潮霉素，均購自Sigma公司；NotⅠ、SfiⅠ酶和X-gal，均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 天然鱟素基因(Tac)序列的人工合成 從GenBank中獲得鱟素Ⅰ的堿基序列，根據(jù)絲狀真菌里氏木霉偏愛密碼子優(yōu)化其序列：在其5′端和3′端分別加上NotⅠ和SfiⅠ酶酶切位點(diǎn)，并補(bǔ)齊宿主中信號(hào)肽的部分序列，設(shè)計(jì)目的基因序列如下：

5′-GGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTAAGTGGTGCTT-CCGCGTCTGCTACCGCGGCATCTGCTACAGGCGATGTCGCTA-AGCGGCCGC-3′，該序列全長(zhǎng)87 bp，委托大連寶生物公司人工合成。

1.2.2 鱟素-里氏木霉表達(dá)載體構(gòu)建 pAN-PSGT全序列9 710 bp，包括Pgpd啟動(dòng)子序列(2 129 bp)、潮霉素抗性基因php序列(1 023 bp)、終止子序列TtrpC(770 bp)、PUC18中從SALI到ECORI之間的序列AP(2 648 bp)、gpd啟動(dòng)子序列(1 347 bp)、信號(hào)肽序列CBHⅠ sig(50 bp)、LacZ序列(1 132 bp)、Tcbh終止子(340 bp)。采用常規(guī)分子重組技術(shù)將鱟素Ⅰ基因Tac連接到gpd-sig和Tcbh中間，構(gòu)建成一個(gè)新的表達(dá)載體pAN-PSGT-Tac，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，采用α互補(bǔ)法(藍(lán)/白斑篩選法)進(jìn)行陽性克隆篩選。菌落PCR法鑒定轉(zhuǎn)化子，用通用引物M13-47/RV-M進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積50 μL，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)大連寶生物有限公司測(cè)定序列。

1.2.3 重組載體pAN-PSGT-Tac轉(zhuǎn)化里氏木霉原生質(zhì)體 里氏木霉原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化在參考Penttila等的方法[9]基礎(chǔ)上改造如下：里氏木霉孢子接種于PDA固體培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng)7 d；無菌水制備孢子懸液，取0.8×108～ 1.0×108個(gè)孢子，接種到40 mL液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、250 r/min 培養(yǎng)11～15 h；待孢子萌發(fā)，取25 mL菌液置于 25 mL 離心管，6 000 r/min 離心5 min；去上清，菌絲用1 mol/L MgSO4洗2遍，8 000 r/min 離心5 min；用10 mL酶解液(100 mg 溶壁酶溶于 10 mL 1 mol/L MgSO4后過濾除菌)重懸菌絲并置于100 mL三角瓶中，28 ℃、70 r/min培養(yǎng)2.0～2.5 h，鏡檢原生質(zhì)體的情況。在酶解液中加入1～2倍體積的STC[1.2 mol/L山梨醇，10 mmol/L Tris·Cl(pH值為7.5)，50 mmol/L CaCl2]8 000 r/min 離心15 min，沉淀原生質(zhì)體。去上清，用STC溶液洗滌原生質(zhì)體2次，8 000 r/min離心10～15 min，最后將原生質(zhì)體懸浮于1 mL STC溶液中。調(diào)整原生質(zhì)體的濃度為108個(gè)/mL，取200 μL，加入20 μg pAN-PSGT-Tac(總體積不超過20 μL)，輕輕混勻；48 ℃熱激2 min；加入50 μL 60%的PEG-4000(用pH值為7.5含50 mmol/L CaCl2和 10 mmol/L Tris·Cl的緩沖液配制)，于室溫靜置20 min。溶液先轉(zhuǎn)移到25 mL離心管中，再加入 2 mL 60%的PEG-4000，混勻后于室溫靜置5 min；加入 20 mL STC，11 000 r/min，離心15 min；用1 mL STC溶液重懸原生質(zhì)體沉淀后加入到10 mL原生質(zhì)體液體再生培養(yǎng)基中，于28 ℃、70 r/min條件下培養(yǎng)20～24 h(原生質(zhì)體長(zhǎng)成微小菌絲即可，若菌絲較大，則涂板后不易區(qū)分單菌落)；8 000 r/min 離心10 min后用0.5～1.0 mL STC溶液懸浮沉淀，將懸浮液涂布于5個(gè)含 100 μg/mL 潮霉素B的PDA固體平板(不含STC)上，28 ℃培養(yǎng)2 d左右；待平板上長(zhǎng)出菌絲(平板底部變黃)，將菌絲連同其下方的一層薄薄的瓊脂塊一同挖下，菌絲朝下接到新的PDA固體小平板上(含80 μg/mL潮霉素B)，28 ℃培養(yǎng)7 d左右。

1.2.4 里氏木霉轉(zhuǎn)化子鑒定

1.2.4.1 轉(zhuǎn)化子潮霉素基因鑒定 將篩選平板上長(zhǎng)出的潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子分別轉(zhuǎn)接到PDA平板上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，1周后首先將各轉(zhuǎn)化子分別接種于液體基本培養(yǎng)基中，提取各轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作為模板，用引物HPH1和HPH2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[10]。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)化子的基因型鑒定 提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA作為模板，由于Tac基因太小，PCR擴(kuò)增存在極大難度，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的鑒定方式為擴(kuò)增Tac基因上下游的片段，分別為gpd-sig-tac-Tcbh、gpd-sig、gpd-sig-tac、tac-Tcbh和Tcbh，如果能擴(kuò)增出這5種片段，則可確定鱟素Ⅰ基因Tac已成功同源替換到里氏木霉基因組DNA上了，并且插入方向正確。擴(kuò)增片段、所需引物和預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小見表1。并將用引物GPD1和TRD3擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)與合成 本研究過程所采用的引物序列見表2，各引物均由大連寶生物公司合成。

表1 擴(kuò)增片段、所需引物和預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小

表2 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 pAN-PSGT-Tac重組載體構(gòu)建

以重組載體為模板，采用PAN-PSGT通用引物M13-47/RV-M進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小約 150 bp，加上鱟素Ⅰ基因87 bp，預(yù)計(jì)目的條帶大小約為 240 bp，電泳結(jié)果見圖1，在250 bp附近發(fā)現(xiàn)1條清晰的條帶，初步確認(rèn)其為目的條帶。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與已知序列同源性達(dá)到100%，確認(rèn)鱟素Ⅰ基因Tac已經(jīng)正確連接至表達(dá)載體PAN-PSGT之中。

2.2 載體pAN-PSGT-Tac對(duì)里氏木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的鑒定

2.2.1 潮霉素基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 提取篩選平板上長(zhǎng)出的潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因，引物為HPH 1和HPH 2。由圖2可知，潮霉素抗性基因hph基因大小為1 023 bp，在1 000 bp處發(fā)現(xiàn)條帶，可以證明潮霉素基因成功擴(kuò)增，初步確定潮霉素基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化。

2.2.2 轉(zhuǎn)化子基因型鑒定 取潮霉素基因鑒定為陽性的菌株，提取其基因組DNA按“1.5.2”節(jié)進(jìn)行基因型鑒定，由圖3可知，以基因組DNA為模板，1泳道為擴(kuò)增出的gpd-sig-tac-Tcbh片段，擴(kuò)增條帶在1 500～2 000 bp之間，符合預(yù)期大小1 824 bp；2泳道為擴(kuò)增出的gpd-sig片段，大小在1 000～1 500 bp 之間，符合預(yù)期大小1 387 bp；3泳道為擴(kuò)增出的gpd-sig-tac片段，大小在1 500 bp附近，符合預(yù)期大小 1 474 bp；4泳道為擴(kuò)增出的tac-Tcbh片段，大小靠近 500 bp，符合預(yù)計(jì)大小427 bp；5泳道為擴(kuò)增出的Tcbh片段，大小在250～500 bp之間，符合預(yù)計(jì)大小340 bp。5種擴(kuò)增都驗(yàn)證為正確，即可初步確定鱟素Tac基因已正確同源整合到基因組DNA上。針對(duì)gpd-sig-tac-Tcbh的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與已知序列的同源性達(dá)100%，可以證明鱟素基因已經(jīng)重組到基因組DNA上。

3 討論

基因重組表達(dá)鱟素Ⅰ的研究開始于20世紀(jì)90年代，但重組鱟素Ⅰ商品至今尚未問世?？傮w而言，國內(nèi)外對(duì)鱟素Ⅰ基因工程表達(dá)主要集中在以細(xì)菌、真菌和藻類為宿主的表達(dá)體系上。

張春義等首次在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)了鱟素Ⅰ，但因需變性和復(fù)性，產(chǎn)品下游處理難度較大[11-12]；Dai等在枯草桿菌WB800中分泌表達(dá)了鱟素Ⅰ，但表達(dá)量最高僅達(dá)到10 μg/mL，與酵母菌是否可分泌性表達(dá)鱟素Ⅰ報(bào)道結(jié)果[6]相差較大。張春義等報(bào)道鱟素基因可克隆至畢赤酵母表達(dá)載體，其誘導(dǎo)分泌產(chǎn)物有抑菌效果，但具體蛋白表達(dá)量均未提及[13-14]；Xu等將鱟素Ⅱ克隆至畢赤酵母SMD1168，鱟素Ⅱ表達(dá)量經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)6 d可達(dá)150 mg/L[15]；Dorrington未能在畢赤酵母發(fā)酵液中檢測(cè)到鱟素Ⅰ[16]；Gao等實(shí)現(xiàn)了鱟素Ⅰ基因和人溶菌酶基因在畢赤酵母的融合表達(dá)，雖然避免了鱟素Ⅰ對(duì)基因工程宿主的抑殺作用，但用特異性蛋白酶切割鱟素Ⅰ與融合蛋白時(shí)，容易造成氨基端出現(xiàn)多余的氨基酸，或切割效率低下，甚至不能切割等[17]；吳順章等[18]、鄧祥元等[19]分別成功地將鱟素Ⅰ基因整合到壇紫菜(紅藻門，多細(xì)胞真核藻)和海帶配子體(褐藻門，單細(xì)胞真核藻)內(nèi)，但前一研究?jī)H在DNA和mRNA層面檢測(cè)到鱟素Ⅰ基因整合到壇紫菜基因組中，未報(bào)告是否表達(dá)了鱟素Ⅰ，后一研究雖表達(dá)了具有活性的鱟素Ⅰ，但其表達(dá)量要低于大腸桿菌表達(dá)體系[11]和枯草桿菌表達(dá)體系[6，10，18-19]。

綜上所述，本課題組觀察了鱟素Ⅰ對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、小球藻和絲狀真菌里氏木霉的抑殺活性，發(fā)現(xiàn)除絲狀真菌里氏木霉外，鱟素Ⅰ對(duì)其余工程宿主的最小抑殺濃度均不超過20 μg/mL[7-8]。因此，本課題組猜想，鱟素Ⅰ可強(qiáng)烈抑殺工程宿主極有可能是其一直難以獲得高效表達(dá)的主要原因。因此，找到比較耐受鱟素Ⅰ抑殺的工程宿主，如絲狀真菌里氏木霉，可能是解決鱟素Ⅰ如何獲得高效表達(dá)的關(guān)鍵。

絲狀真菌里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶等已有多年的歷史，該菌株在產(chǎn)酶條件下不產(chǎn)生毒素。實(shí)踐還表明，經(jīng)基因工程手段改造的里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)異源蛋白過量表達(dá)。Emilio等將TrichodermaharzianumP1的幾丁質(zhì)酶編碼基因置于里氏木霉CBH Ⅰ啟動(dòng)子之后，搖瓶產(chǎn)量可達(dá)130 mg/L(達(dá)到原產(chǎn)菌株的20倍)[20]。幾丁質(zhì)酶能抑制多種真菌的生長(zhǎng)，但里氏木酶卻能高效生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶?？稍诶锸夏久怪蝎@得高效表達(dá)的異源蛋白還有肌醇六磷酸酶(2 g/L)、哺乳動(dòng)物的牛凝乳蛋白酶(40 mg/L)、抗體片段(150 mg/L)和人N-乙酰葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等[21]。但迄今為止，抗菌肽能否在絲狀真菌里氏木霉系統(tǒng)中得到高效表達(dá)尚不清楚。

本研究根據(jù)里氏木霉偏愛密碼子優(yōu)化了鱟素Ⅰ的基因序列，人工合成了該序列，采用酶切、連接等方法將鱟素Ⅰ基因成功連接至里氏木霉表達(dá)載體pAN-PSGT之上，構(gòu)建了 pAN-PSGT-Tac重組表達(dá)載體。pAN-PSGT表達(dá)載體無需“共轉(zhuǎn)法”，可“單轉(zhuǎn)法”即直接用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化里氏木霉原生質(zhì)體；pAN-PSGT采用里氏木霉QM9414 CBH Ⅰ的信號(hào)肽來引導(dǎo)目的蛋白的分泌。Kuo等發(fā)現(xiàn)許多真菌的gpd啟動(dòng)子可用于重組蛋白的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄過程中，提高目的產(chǎn)物的表達(dá)水平[22]。同時(shí)，信號(hào)肽可引導(dǎo)目的蛋白分泌到胞外，產(chǎn)物分離時(shí)不必破碎宿主細(xì)胞，同時(shí)分泌到胞外的蛋白往往都具有正確的空間折疊構(gòu)象，利于下游的分離純化；pAN-PSGT中帶有LacZ基因，可通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆。

采用PEG介導(dǎo)法將重組表達(dá)載體pAN-PSGT-Tac轉(zhuǎn)化至里氏木霉QM9414原生質(zhì)體，潮霉素篩選得到了重組子，基因型鑒定結(jié)果表明，鱟素Ⅰ基因已經(jīng)重組到基因組DNA上，說明本研究成功構(gòu)建了鱟素Ⅰ里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)。利用本系統(tǒng)表達(dá)鱟素Ⅰ蛋白的研究需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了鱟素Ⅰ-里氏木霉表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)化至里氏木霉QM9414細(xì)胞中。這一結(jié)果為進(jìn)一步改進(jìn)鱟素Ⅰ在里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于其他小分子肽類蛋白在絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)也具有一定的指導(dǎo)意義。